劉廣定臺灣大學：化學研究所蘇喬勇Su, Chiao-YungChiao-YungSu2007-11-262018-07-102007-11-262018-07-102005http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/51902本研究討論利用從大腸桿菌轉植的胺基肽酶P(Aminopeptidase P, AMPP)來作為有機磷化物(organophosphorus compound)的催化水解以達成解毒的功能，其機制是將磷化物水解成相對毒性較低的亞磷酸類(Phosphonic acid)化合物。根據先前研究發現AMPP可以水解磷酸三酯類(phosphate triester)的化合物，現在繼續合成兩個系列亞磷酸雙酯類(phosphonate diester)的化合物。這兩個系列化合物的三個取代基，除了接4-硝基酚作為偵測的機團之外，另外兩個取代基R1及R2分別是R1 = -CH3、-CH2CH3取代，而其中R1 = -CH3是神經毒劑沙林的類似物。另一個取代基R2 = -Me、-Et、-nPr、-iPr、-secBu、-Ph，各化合物的濃度是在500 μM下偵測其水解速率，這些化合物的水解速率以R1 = -CH3，R2 = -Me的為最快，並且比先前的磷酸三酯類催化速率最快的化合物還要在高上7- 15倍。除此之外我們並且也作了一系列定點突變的酵素來測試其水解速率，效果也都不錯。我們還作了原生態(wild type)及各突變種酵素(mutants)對於水解化合物10的立體選擇性及反應機制探討。首先我們將最好效果的R1 = -CH3及R2 = -Me的化合物拿來作為立體選擇性的實驗化合物，將P＝O轉換成P＝S，使磷除了是一具立體中心的化合物外，其水解之後產物一樣具立體中心，之後讓各酵素來水解以探討其選擇性，我們也作了氧-18同位素效應及以S-式的化合物Sp-10讓酵素來水解以進行反應機制探討。Previous catalytic studies have shown that the aminopeptidase P (AMPP) from Escherichia coli catalyzes the hydrolysis of a variety of organophosphate triesters, which includes an array of insecticides. Herein we report another novel activity of AMPP to degrade methylphosphonates (sarin analogues) and ethylphosphonates. A series of racemic mixtures of methylphosphonates and ethylphosphonates containing various combinations of methyl, ethyl, i-propyl, n-propyl, sec-butyl, and phenyl substitutes were prepared as probes of the structural constraints within the active site of AMPP. This result demonstrates that wild type AMPP favors the hydrolysis of compound 4, O-methyl p-nitrophenyl methylphosphonate. At a concentration of 500 μM compound 4 is hydrolyzed 7- to 15-fold faster than are the corresponding analogues (5-9). Enzymatic hydrolysis of O,O-diisopropyl-p-nitrophenyl phosphate (20) in H218O observed 18O-labeled O,O-diisopropyl phosphate product only and confirmed that the catalytic reaction took place with cleavage of P-O bond. From chemical and kinetic studies, the utilization of a optically pure Sp-10 has demonstrated that the enzymatic reaction proceeds via an SN2-like mechanism and in situ generates a chiral product with an inversion of stereochemical configuration at the phosphorus atom. The results finally conclude that enlargement of the active site through the site-directed mutagenesis does result in a preference toward the Sp-isomer of O-methyl p-nitrophenyl methylphosphonothioate(Sp-10).目 錄 一、導論----------------------------------------------------------------------------1 1、前言-----------------------------------------------------------------------1 2、化學武器簡介-----------------------------------------------------------5 3、酵素解毒----------------------------------------------------------------10 二、結果與討論------------------------------------------------------------------23 三、結論---------------------------------------------------------------------------70 四、實驗與光譜數據------------------------------------------------------------72 1、實驗儀器-----------------------------------------------------------------72 2、實驗藥品----------------------------------------------------------------74 3、實驗步驟及光譜數據-------------------------------------------------78 (A)有機合成步驟及光譜數據--------------------------------------78 (B)生化實驗方法----------------------------------------------------100 (一)酵素水解速率實驗步驟----------------------------------100 (二)化學水解實驗步驟----------------------------------------101 (三)酵素AMPP原生態及各單點突變及雙點突變對於化合物10之立體選擇性實驗------------------------------101 (四)酵素反應機制探討實驗步驟----------------------------103 五、參考文獻-------------------------------------------------------------------106 六、附圖-------------------------------------------------------------------------110 圖目錄： 圖一 神經毒氣沙林及梭曼的結構------------------------------------1 圖二 乙醯膽鹼酶在人體內所扮演的功能---------------------------2 圖三 乙醯膽鹼酶進行正常催化反應及遇到有機磷化合物時的 反應機制示意圖---------------------------------------------------3 圖四 常見神經毒劑GA、GB及GD結構---------------------------7 圖五 常見化學戰毒劑VX、Mutard、BZ及CN------------------ 7 圖六 神經毒氣沙林及梭曼的的合成步驟---------------------------8 圖七 芥子氣的合成步驟------------------------------------------------9 圖八 鹼性試劑對沙林水解示意圖------------------------------------9 圖九 神經毒劑沙林及殺蟲劑parathion、paraoxon結構---------10 圖十 PTE對於有機磷化物解毒機制示意圖-----------------------11 圖十一 PTE活化中心示意圖--------------------------------------------12 圖十二 PTE對化合物EPN催化水解之立體反應機制示意圖----12 圖十三 有機磷化物結構--------------------------------------------------12 圖十四 PTE WT及各Mutant對於磷化物立體選擇性之比較-----15 圖十五 氨基酸glycine及alanine結構---------------------------------15 圖十六 氨基酸histidine及tyrosine結構-------------------------------16 圖十七 PTE水解paraoxon反應機制示意圖-------------------------17 圖十八 AMPP X-ray單晶繞射結構圖---------------------------------19 圖十九 AMPP活化中心示意圖-----------------------------------------19 圖二十 磷酸三酯化合物A-G結構圖---------------------------------21 圖二十一 AMPP水解化合物A-G催化速率---------------------------21 圖二十二 各磷酸三酯衍生物結構圖--------------------------------------23 圖二十三 神經毒氣G系列類似物結構示意圖--------------------------24 圖二十四 化合物4-9合成步驟--------------------------------------------25 圖二十五 化合物4-9結構--------------------------------------------------26 圖二十六 Michaelis-Arbuzov反應之反應機構示意圖-----------------28 圖二十七 Michaelis-Arbuzov反應可能產生之副產物-----------------29 圖二十八 化合物2反應中間產物及終極產物結構-------------------30 圖二十九 化合物1、2i、2在磷譜的化學位移----------------------------31 圖三十 化合物26-31的合成步驟--------------------------------------32 圖三十一 化合物26-31結構-----------------------------------------------33 圖三十二 AMPP水解化合物4-9示意圖--------------------------------33 圖三十三 磷酸三酯化合物32, 33及亞磷酸雙酯化合物4, 7, 8結構------------------------------------------------------------35 圖三十四 氨基酸arginine、tryptophan、leucine及alanine結構----36 圖三十五 AMPP水解化合物26-29示意圖--------------------------38 圖三十六 化合物10合成步驟---------------------------------------------41 圖三十七 Lawesson’s Reagent結構-------------------------------------41 圖三十八 化合物10合成步驟之反應機構-------------------------------42 圖三十九 解析試劑(S)-(-)-1-Phenylethylamine及(-)-Strychnine 結構-----------------------------------------------------------------43 圖四十 化合物10之化學水解反應步驟------------------------------43 圖四十一 化合物10之化學水解產物NMR磷譜圖-------------------44 圖四十二 AMPP WT及各Mutant對於化合物10水解之產物NMR 磷譜圖--------------------------------------------------------------47 圖四十三 AMPP水解化合物10之反應步驟--------------------------48 圖四十四 AMPP水解化合物10之反應結果立體化學分析圖------49 圖四十五 酵素催化水解反應之反應機制推測圖-----------------------52 圖四十六 化合物20之化學水解反應步驟------------------------------54 圖四十七 化合物20酵素水解之同位素效應反應步驟---------------54 圖四十八 18O同位素效應NMR磷譜圖----------------------------------55 圖四十九 EDTA結構圖--------------------------------------------------57 圖五十 化合物RpSc-13之反應合成步驟----------------------------59 圖五十一 化合物RpSc-13的X-Ray單晶繞射結構圖-----------------60 圖五十二 利用兩種催化試劑之化合物Sp-10合成步驟-------------61 圖五十三 推測之BF3及H2SO4催化產生化合物Sp-10之 反應機制-----------------------------------------------------------62 圖五十四 化合物10之化學水解反應步驟(STEP A)-----------------63 圖五十五 化合物Sp-10之酵素及化學水解步驟(STEP B及STEP C)-------------------------------------------------------------------63 圖五十六 產物10化學水解產物NMR光譜圖-------------------------64 圖五十七 從BF3催化得到之化合物Sp-10酵素水解及化學水解產物 NMR磷譜--------------------------------------------------------65 圖五十八 從H2SO4催化得到之化合物Sp-10酵素水解及化學水解產物NMR磷譜---------------------------------------------------66 圖五十九 化合物Sp-10經酵素水解可能的產物之 反應機制分析-----------------------------------------------------67 圖六十 酵素(AMPP)催化有機磷化物最可能之路徑---------------69 表目錄： 表一 傳統加熱反應及微波反應比較--------------------------------29 表二 AMPP WT及各突變種對於化合物4-9的 水解速率測定----------------------------------------------------34 表二 AMPP WT及各突變種對於化合物26-29的 水解速率測定----------------------------------------------------38 表三 AMPP WT及各mutant對於化合物10的 立體選擇性-------------------------------------------------------50en-US解毒沙林水解微波酵素detoxificationsarinhydrolysismicrowaveenzymethesis