指導教授：張雅君臺灣大學：植物病理與微生物學研究所李芷菁Lee, Chih-ChingChih-ChingLee2014-11-292018-06-292014-11-292018-06-292014http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/263056紅龍果為仙人掌科三角柱屬(Hylocereus spp.)之多年生攀附性植物，亦為近年台灣大力推廣之熱帶水果，其田間栽種植株常遭受病毒為害。目前國內已發現紅龍果被仙人掌X病毒(Cactus virus X, CVX)、蟹爪蘭X病毒(Zygocactus virus X, ZyVX)及紅龍果X病毒(Pitaya virus X, PiVX)所感染，且這三種potexvirus病毒普遍存在全台各地紅龍果果園中。PiVX為本實驗室所發現鑑定之Potexvirus屬新病毒，我們從感染PiVX的紅龍果植株萃取總量RNA，以北方雜合分析發現一些小片段RNA與PiVX探針有反應；進一步選殖與序列分析，確認其為源自PiVX的缺失性RNA (defective RNA, dRNA)。dRNA為病毒基因體RNA經過缺失與重組後產生的次病毒分子，需輔助病毒(helper virus)提供複製酵素、鞘蛋白與移動蛋白等，才能在寄主體內複製、包被與移行。從紅龍果所選殖到不同長度之PiVX dRNA選殖株，先製備成RNA轉錄體，再與PiVX共同接種菸草原生質體，以篩選在輔助病毒存在下，複製效率最佳的dRNA。經過數次的原生質體接種試驗，篩選出增殖能力最佳的P1 dRNA，其保留了5’端645 nt與3’端196 nt，總長度為841 nt。為了將PiVX dRNA改造為可應用在植物上的病毒載體，我們以P1 dRNA為基礎，構築兩種以不同方法表現綠色螢光基因(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的載體，分別為P1-EF與P1-E。P1-EF以複製酶的轉譯架構與外源基因結合，以形成融合蛋白；P1-E為將PiVX鞘蛋白基因之次基因啟動子(subgenomic promoter, SGP)加入PiVX dRNA中，以SGP表現外源基因。其中，P1-E已成功在菸草原生質體及白藜植株中表現EGFP，但表現效率並不高。故嘗試短暫表現基因靜默抑制子p19於菸草與白藜植株，以期加強P1-E表現EGFP之能力；結果在白藜植株上，p19對EGFP之表現沒有顯著影響。而在非繁殖寄主菸草上，先短暫表現p19後再接種P1-E，可以抗體偵測到PiVX鞘蛋白在菸草中累積，但以GFP抗體仍然無法偵測到訊號。此外，欲研究P1 dRNA可被PiVX辨識並增殖的cis-acting elements序列，我們構築數個序列刪除株，同樣以菸草原生質體分析其活性。目前研究結果顯示PiVX dRNA的5’端只需保留435 nt，即可被PiVX輔助病毒所辨識並增殖。另外，我們也由紅龍果中分離出CVX的缺失性RNA，其保留5’端677 nt及3’端591 nt，總長度為1268 nt。進一步將其RNA轉錄體與PiVX以菸草原生質體測試活性，結果發現CVX dRNA可被PiVX複製，顯示CVX dRNA所保留的序列具有被PiVX複製酶辨識的cis-acting elements。Pitaya, a climbing succulent plant in the family Cactaceae, has gradually become an important economic fruit in Taiwan. However, its cultivation is restricted by viral diseases. Cactus virus X (CVX), Zygocactus virus X (ZyVX) and Pitaya virus X (PiVX) have been reported to infect pitaya in Taiwan. These viruses are commonly found in the field. PiVX is a new member of the Potexvirus genus identified in our lab. We extracted total RNA from infected pitaya and discovered some small RNAs reacting to PiVX probe by Northern blot. After cloning and sequence analysis, we confirmed that these small RNAs are defective RNAs (dRNAs) of PiVX. dRNAs are subviral RNAs produced from RNA virus via deletion and recombination. dRNAs depend on their parental virus (helper virus) to replicate, encapsidate and move in host plant. To select the PiVX dRNAs with best infectivity, transcripts of different dRNA clones from pitaya were analyzed with the help of PiVX transcripts in Nicotiana benthamiana protoplasts by Northern blot. After several independent inoculation assays, we found P1 dRNA, which contains 5’ 645 nt region and 3’ 196 nt region with its total length of 841 nucleotides had the best replication ability. In order to develop PiVX dRNA as a virus expression vector, we used P1-based vector to express enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene by two different ways and thus constructed P1-EF and P1-E. P1-EF combined the open reading frame of RNA-dependent RNA Polymerase (RdRP) with foreign gene to form a fusion protein. P1-E recruited the subgenomic promoter (SGP) of PiVX into P1 dRNA to express foreign gene through sgRNA expression。According to experimental results, P1-E could successfully express EGFP in N. benthamiana protoplasts and Chenopodium quinoa plants, but the expression efficiency was low. To improve the expression efficacy of P1-E, we tried to express p19, a gene silencing suppressor, in N. benthamiana and C. quinoa plants. The results indicated p19 had no significant effect on the expression of EGFP in C. quinoa plants. However, when P1-E was inoculated to N. benthamiana plant after transient expression of p19, PiVX CP accumulation increased but EGFP expression could not be detected by GFP antibody. In addition, in order to study the cis-acting elements that can be recognized and replicated by PiVX, we constructed and analyzed some deletion mutants of P1 dRNA in N. benthamiana protoplasts. The current result indicated that the dRNA containing only 5’ 435 nt region and 3’196 nt region could still be replicated by helper virus. Furthermore, we also cloned CVX dRNAs from pitaya plant, which contain CVX 5’ 677 nt region and 3’ 591 nt region with its total length of 1268 nucleotides. For testing the biological activity, transcripts of CVX dRNAs together with PiVX were inoculated to N. benthamiana protoplasts, and Northern blot demonstrated CVX dRNAs could be replicated by PiVX. Accordingly, the result suggested that PiVX RdRP can recognize the cis-acting elements of CVX dRNAs.中文摘要 I Abstract III 壹、 前言 1 一、缺失性RNA研究歷史 1 二、缺失性RNA之形成與特性 2 三、 缺失性RNA之應用 3 四、 病毒載體之研究 4 五、 基因靜默抑制子之應用 5 六、 紅龍果病毒X及仙人掌病毒X之介紹 6 七、 PiVX缺失性RNA及鞘蛋白次基因啟動子(subgenomic promoter, SGP)之研究 6 八、 研究動機 7 貳、材料與方法 9 二、 實驗植物與栽種 9 三、 缺失性RNA之選殖 10 (一)小量植物全RNA之萃取 10 (二)反轉錄聚合酶鏈鎖反應 10 (三)從膠體回收核酸 11 (四)限制酶截切反應與去磷酸化反應 12 (六)轉型作用 12 (七)正確選殖株之篩選 13 1. 菌落聚合酶連鎖反應 13 2. 小量質體DNA製備與篩選 13 3. pUC-P1 dRNA之構築 14 4. 序列比對與分析 14 四、生體外轉錄體之製備 14 (一) 限制酶直線化質體 14 (二) 生體外轉錄反應 15 五、原生質體之製備、接種與分析 15 (一) 原生質體之製備 15 (二) 原生質體之接種 16 (三) 原生質體之全RNA之萃取與分析 16 六、缺失性RNA在白藜上之接種 17 七、 北方轉漬與雜合法分析 17 (一) PiVX 5’端、CVX 3’端與EGFP專一性DNA探針之製備 17 (二) 北方轉漬法 18 (三) 北方雜合反應 18 八、pUC-P1-EF及pUC-P1-E之構築 19 九、p35S-P1-E與 pGR-P1-E 之構築 20 十、影響PiVX複製之cis-acting elements分析 20 (一) 構築5’端不同長度之缺失性RNA 20 (二) 菸草原生質體接種與分析 21 十一、接種紅龍果實生苗 21 十二、以農桿菌注射法進行病毒選殖株之接種 22 (一) 農桿菌轉型 22 (二) 農桿菌注射法 22 十三、以農桿菌注射表現Tomato bushy stunt virus (TBSV) P19蛋白於菸草及白藜 22 (一) 以農桿菌表現P19蛋白後再表現EGFP 22 (二) 以農桿菌表現P19與EGFP 23 十四、西方轉漬分析法 23 (一) 聚丙烯醯氨膠體電泳 23 (二) 樣品製備及聚丙烯醯氨膠體電泳分析 24 (三) 免疫轉漬分析 24 參、結果 26 一、 PiVX缺失性RNA之選殖與分析 26 二、測試PiVX缺失性RNA於菸草原生質體中之複製能力 27 三、測試PiVX缺失性RNA於白藜植株系統葉之累積能力 27 四、以PiVX缺失性RNA為載體表現外源蛋白 28 (一)以菸草原生質體分析P1載體利用鞘蛋白次基因體RNA啟動子或表現融合蛋白之方法表現綠色螢光蛋白之效果 28 (二) 以白藜植株分析P1載體利用鞘蛋白次基因體RNA啟動子表現綠色螢光蛋白之效果 29 五、 PiVX複製相關cis-acting elements之分析 31 六、 測試CVX缺失性RNA在PiVX幫助下於菸草原生質體之複製能力 31 (一) CVX缺失性RNA之選殖與分析 31 (二) CVX缺失性RNA在PiVX協助下於菸草原生質體中之複製能力 32 肆、討論 33 一、 PiVX與CVX缺失性RNA之選殖 33 二、以PiVX缺失性RNA於菸草原生質體表現外源基因 34 三、iVX缺失性RNA於白藜植株表現外源基因 36 四、表現p19對缺失性RNA載體之影響 37 五、桿菌注射法同時表現p19與PiVX缺失性RNA載體 38 六、PiVX製相關之cis-acting elements 區域 39 七、CVX缺失性RNA之分析 39 八、 結語 40 伍、參考文獻 42 陸、表 49 柒、圖 50 捌、附錄 642492166 bytesapplication/pdf論文公開時間：2019/09/02論文使用權限：同意無償授權紅龍果X病毒仙人掌X病毒cis-acting elements缺失性RNA病毒載體次基因啟動子thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/263056/1/ntu-103-R01633014-1.pdf