陳昭瑩臺灣大學：植物病理與微生物學研究所楊憶華Yang, I-HuaI-HuaYang2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/58027土壤中存有大量根圈細菌，這些細菌能夠群聚並長期存活於植物根圈，分泌物質提供植物養份，並促進植物生長，被稱為促進植物生長之根圈細菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)。許多PGPR菌株為螢光假單胞菌(fluorescent pseudomonads)，已知多種Pseudomonas fluorescens及Pseudomonas putida菌株能防治植物之葉部及根部病害。以生化方法收集P. putida拮抗菌株LY95及其產生幾丁質分解酵素之遺傳工程菌株的周質、細胞質、內膜和外膜分段液，比較幾丁質分解酵素的活性，在P. putida LY95(pMMST2000)外膜及內膜可偵測到幾丁質分解酵素，利用西方免疫法估計其分子量約為94 kDa。 P. putida LY95(pMMST2000)經免疫螢光染色，以螢光顯微鏡及雷射共軛焦掃描顯微鏡觀察，均可在其一細胞表面觀察到螢光。螢光基質分析顯示P. putida LY95(pMMST2000)之培養上清液也可偵測到幾丁質分解酵素活性；以P. putida LY95(pMMST2000)培養18小時之上清液處理百合及番茄之萎凋病菌及灰黴病菌，皆有抑制孢子發芽的作用。於溫室中，P. putida LY95(pMMST2000)能有效地降低百合及番茄萎凋病及灰黴病的罹病度，顯示表現幾丁質分解酵素分佈於細胞表面的方式，可增加P. putida之抑菌活性及生物防治活性。Rhizosphere bacteria are present in large number in the soil where nutrients are provided by plant root exudates. Their application can stimulate plant growth, therefore being named plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR). Fluorescent Pseudomonads such as Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida are able to suppress plant diseases. In this study, the periplasmic, cytoplasmic, inner membrane and outer membrane fractions of a Pseudomonas putida wild type strain LY95, and its genetic engineering strains were isolated by biochemical method. The inner and outer membrane locations of chitinase in P. putida LY95(pMMST2000) were indicated by Western blot analysis with ChiA1 antibody. Molecular mass of detected protein was estimated to be 94 kDa. Fluorescence was observed on bacteria cell surface of FITC-labelled P. putida LY95(pMMST2000) by fluorescence and confocal laser scanning microscopy. By fluorometric assay, chitinase activity was detected in the culture supernatant of P. putida LY95(pMMST2000). The culture supernatant of P. putida LY95(pMMST2000) was capable of inhibiting conidial germination of Botrytis spp. and Fusarium spp. Application of P. putida LY95(pMMST2000) effectively decrease disease severity caused by Botrytis spp. and Fusarium spp. on lily and tomato, suggesting that expression of chitinase in P. putida transformant and translocation of chitinase to bacterial suface could increase its antifungal and biocontrol activity.壹、中文摘要…………………………………………………………………………..1 貳、前言………………………………………………………………………………..2 參、前人研究………………………………………………………………………….4 一、根圈細菌……………………………………..……………………………….4 二、Pseudomonas putida之分類及生理生化特性……………….………………5 三、Pseudomonas putida防治植物病害之作用機制……………………………5 四、幾丁質分解酵素在植物病害防治上之重要性及應用…………….………...7 五、Pseudomonas putida根圈細菌防治植物病害之田間試驗…………………9 肆、材料與方法………………………………………………………………………11 一、供試菌株…………………………….……………………………………….11 二、Pseudomonas putida LY95轉形菌株生長特性分析………………………..11 1. 碳素源利用性……………………………………………….…………..11 2. 生長曲線分析………………………….………………………………..12 三、Pseudomonas putida LY95轉形菌株幾丁質分解酵素活性及次細胞定位分 析………………………………………………………………………..…..12 1. IPTG誘導之影響…………………………………………..……………12 2. Pseudomonas putida LY95轉形菌株次細胞分段液收集………………13 3. 蛋白質定量……………………………………………………..……….14 4. NADH oxidase分析……………………………………………...………14 5. 2-keto-3-deoxyoctonate分析……………………..……………...………14 6. 幾丁質分解酵素活性螢光基質分析法………………...………………14 四、Pseudomonas putida LY95幾丁質分解酵素之膠體活性及免疫偵測分析..15 1. SDS-聚丙醯胺膠體電泳分析…………………………………...………15 2. 幾丁質分解酵素之膠體活性分析………..…………………………….15 3. 西方免疫雜交分析………………………………...…..………………..16 五、Pseudomonas putida LY95轉形菌株之免疫螢光染色…………………….16 六、Pseudomonas putida LY95轉形菌株胞外幾丁質分解酵素活性分析…….17 七、Pseudomonas putida LY95野生型及轉形菌株培養上清液生體外抗菌分 析…………………………………………...……………………………….18 八、Pseudomonas putida LY95野生型及轉形菌株對真菌性病害之生物防治試 驗………………………………………………………………………..….18 1. 供試植株……………………………………………………………….....18 2. 細菌懸浮液製備………………………………………………………….19 3. 灰黴病生物防治試驗…………………………………….….…………...19 4. 萎凋病生物防治試驗…………………………………….….…………...19 伍、結果……………………………………………………………………………..21 一、Pseudomonas putida LY95轉形株之特性…………………………………21 二、Pseudomonas putida LY95轉形株經IPTG誘導之幾丁質分解酵素於活性 分析……………………...……………………..…………………………...21 三、幾丁質分解酵素於Pseudomonas putida LY95轉形菌株之次細胞定位分 析…………………………………………………………………………....22 四、Pseudomonas putida LY95轉形菌株表現幾丁質分解酵素之免疫螢光染 色……………………………………………………………...…………….24 五、Pseudomonas putida LY95轉形菌株胞外幾丁質分解酵素活性…………24 六、Pseudomonas putida LY95表現幾丁質分解酵素之抑菌作用……………25 七、Pseudomonas putida LY95野生型及轉形菌株之生物防治效果分析……26 陸、討論……………………………………………………………………………..28 柒、參考文獻………………………………………………………………………..31 捌、圖表集…………………………………………………………………………..39 表一、Pseudomonas putida轉形菌株碳素源利用性分析……………………40 表二、Pseudomonas putida轉形菌株幾丁質分解酵素活性分析……………41 表三、Pseudomonas putida轉形菌株次細胞分段液幾丁質分解酵素活性分 析…………………………………………………………………..……42 表四、Pseudomonas putida LY95防治灰黴病及萎凋病分析………………..43 表五、Pseudomonas putida LY95轉形菌株防治灰黴病分析………………..44 表七、Pseudomonas putida LY95轉形菌株防治萎凋病分析….……………..45 圖一、質體pMMB6圖譜及pNTU118、pMMST2000插入DNA之遺傳結構..46 圖二、Pseudomonas putida LY95轉形菌株之生長曲線……………………..47 圖三、Pseudomonas putida細胞內膜及外膜之分離…………………………48 圖四、Pseudomonas putida細胞膜蔗糖梯度離心分段液之NADHoxidase活性 分析…………………………………………………………..…………..49 圖五、Pseudomonas putida細胞膜蔗糖梯度離心分段液之 2-keto-3-deoxyoctonate含量分析……………………………….……..50 圖六、Pseudomonas putida LY95轉形株之周質、細胞質及細胞內外膜分段液 之SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳及膠體內幾丁質分解酵素活性分析…...51 圖七、Pseudomonas putida LY95轉形菌株西方免疫轉漬分析(ChiA1抗體). 52 圖八、Pseudomonas putida LY95轉形菌株西方免疫轉漬分析(OmpA抗體). 53 圖九、Pseudomonas putida 野生型菌株及轉形株之幾丁質分解酵素定位分析 (螢光顯微鏡)………………...…………………………………………54 圖十、Pseudomonas putida 野生型菌株及轉形株之幾丁質分解酵素定位分析 （共軛焦雷射掃描顯微鏡）……………..………………………………55 圖十一、Pseudomonas putida轉形菌株培養不同時間上清液幾丁質分解酵素 活性分析……………………………………………………………..56 圖十二、以膠體內活性染色偵測Pseudomonas putida轉形株培養上清液幾丁 質分解酵素活性……………………………………...……………….57 圖十三、Pseudomonas putida 野生型及轉形菌株培養上清液對Botrytis elliptica分生孢子發芽之影響………………………………………58 圖十四、Pseudomonas putida 野生型及轉形菌株培養上清液對Botrytis cinerea分生孢子發芽之影響………………………………………59 圖十五、Pseudomonas putida 野生型及轉形菌株培養上清液對Fusarium oxysporium f. sp. lilii分生孢子發芽之影響…………...……………60 圖十六、Pseudomonas putida 野生型及轉形菌株培養上清液對Fusarium oxysporium f. sp. lycopersici分生孢子發芽之影響………...………61 玖、英文摘要………………………………………………………………………..62743851 bytesapplication/pdfen-US生物防治抑菌活性促進植物生長之根圈細菌螢光假單胞菌細菌幾丁質分解酵素chitinasebiocontrolantifungal activityplant growth-promoting rhizobacteriafluorescent Pseudomonadsotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/58027/1/ntu-93-R90633007-1.pdf