詹東榮臺灣大學：獸醫學研究所陳永俐Chen, Yung-LiYung-LiChen2007-11-282018-07-092007-11-282018-07-092004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/60019本實驗使用人類周邊血液單核球(peripheral blood monocytes)分化為未成熟樹狀細胞（immature dendritic cell；iDC）的實驗模式，探討檳榔萃取物（areca nut extract；ANE）和檳榔鹼（arecoline；AR）對DC分化（differentiation）及反應性之影響。在DC分化方面，PBMC加入ANE 10 - 20 mg/mL或AR 10 - 100 mM培養7天後，分化成為iDC的數量顯著較未處理藥物之對照組少，且ANE使已分化之iDC的存活率明顯降低。以流式細胞儀分析PBMC培養7天後之細胞表面抗原，圈選體積較大、顆粒性較高之細胞分群進行分析，結果顯示ANE 10 mg/mL及AR 100 mM處理使CD1a的表現減少，ANE 20 mg/mL處理使CD1a 、CD40及CD86的表現減少；相同實驗以流式細胞儀分析未經圈選的PBMC培養7天後之全體細胞，ANE 20 mg/mL處理使CD40的表現減少，AR 100 mM處理使HLA-DR及CD1a的表現減少，但AR 10、100 mM處理則使CD86的表現上升。在iDC的細胞形態方面， ANE 25 mg/mL及AR 500 mM以上濃度在24小時內使細胞呈現圓形化，但以MTT試驗法檢測iDC的細胞代謝活性，則發現在24小時作用下LPS 10 ng/mL、ANE 10 - 200 mg/mL及AR 10 mM對細胞代謝活性均無影響，只有AR 50 mM以上濃度使細胞代謝活性下降。在iDC的反應性方面，iDC以ANE 10、20 mg/mL及AR 10、100 mM預先處理30分鐘，再加入LPS 10 ng/mL刺激24小時，以流式細胞儀檢測體積較大、顆粒性較高之細胞分群，結果顯示藥物處理組與LPS刺激組的表面抗原表現無顯著差異。iDC的反應性以反轉錄聚合酶鏈連鎖反應（RT-PCR）檢測IL-12B（p40）mRNA的表現，結果顯示LPS明顯刺激iDC 表現IL-12B，而此表現會受到ANE 10、20 mg/mL及AR 100 mM的抑制。綜合上述，本研究指出ANE及AR對於人類DC之分化及其反應性具有明顯影響，除了使分化的iDC細胞數量減少，表面抗原表現傾向分化不完全以外，ANE與AR對於iDC的反應性亦有顯著的抑制作用。The effect of areca nut extracts (ANE) and arecoline (AR) on the differentiation and activation of dendritic cells (DC) was investigated in the present studies. Monocytes isolated from human peripheral blood were cultured in RPMI medium supplemented with GM-CSF and IL-4 to generate DC. Several lines of evidence suggested that the differentiation of DC from monocytes was suppressed by the presence of ANE or AR. First, the cell number of immature DC obtained following 7-day culture of monocytes was decreased in the presence of ANE (10 - 20 mg/mL) or AR (10 - 100 mM). Second, the viability of DC was decreased by ANE treatment. Lastly, the expression of surface markers of DC was influenced by ANE or AR treatment as determined by flow cytometry. The expression of CD40 on total harvested cells was decreased by ANE (20 mg/mL), and the expression of HLA-DR and CD1a was attenuated by AR (100 mM). Similar results were also observed in selected cell populations with larger size. The morphological studies revealed that a higher percentage of iDC remained in round shape in the presence of ANE (25 mg/mL) or AR (500 mM), as compared to the control group. However, the metabolic activity of iDC was not significantly affected by ANE treatment as measure by a MTT assay. In contrast, the metabolic activity of iDC was suppressed by treatments with AR (50 - 1000 mM). Furthermore, the effect of ANE and AR on the reactivity of iDC was studied. Both ANE and AR did not affect the expression of cell surface markers on iDC stimulated with LPS. However, the induction of IL-12B mRNA expression by LPS in iDC was markedly suppressed by pretreatment of cells with ANE (20 mg/mL) or AR (10 - 100 mM). Taken together, the present studies demonstrated that the differentiation of iDC from monocytes and the activation of iDC were significantly suppressed by the presence of ANE and AR.中文摘要-I 英文摘要-II 目錄-III 表次-V 圖次-V 第一章、緒論-1 第二章、文獻探討 第一節、樹狀細胞之生物學及功能 一、樹狀細胞在免疫學扮演之角色-2 二、樹狀細胞的特徵及分型-3 三、樹狀細胞之實驗模式-4 四、樹狀細胞之免疫調控功能-6 第二節、檳榔塊簡介 一、檳榔的使用文化-7 二、檳榔的組成與主要成分-8 三、檳榔對口腔健康危害與致癌機轉-9 第三節、檳榔成分與腫瘤免疫-10 第三章、實驗材料與方法 第一節、實驗設計與流程圖 一、實驗設計-12 二、實驗流程圖-13 第二節、實驗材料來源 一、檳榔萃取物-13 二、檳榔鹼-14 三、人類全血來源-14 第三節、實驗方法 一、建立由人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞之培養模式-14 二、以流式細胞儀檢測人類未成熟樹狀細胞表面抗原之表現-16 三、以trypan blue排除試驗法檢測人類未成熟樹狀細胞之細胞濃度及存活率-17 四、以流式細胞儀檢測檳榔萃取物及檳榔鹼對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於細胞表面抗原表現之影響-17 五、以MTT試驗法檢測人類未成熟樹狀細胞之代謝活性-18 六、以流式細胞儀檢測人類未成熟樹狀細胞經LPS刺激下細胞表面抗原之表現-19 七、以RT-PCR法檢測人類未成熟樹狀細胞IL-12B mRNA表現量的變化-20 八、統計方法-23 第四章、實驗結果 第一節、建立由人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞之培養模式-24 第二節、檳榔萃取物及檳榔鹼對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞之影響 一、檳榔萃取物及檳榔鹼對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於形態、細胞濃度及存活率之影響-25 二、檳榔萃取物及檳榔鹼對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於細胞表面抗原表現之影響-26 三、檳榔萃取物及檳榔鹼對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於全體細胞表面抗原表現之影響-27 第三節、檳榔萃取物及檳榔鹼對人類未成熟樹狀細胞代謝活性之影響 一、檳榔萃取物及檳榔鹼對人類未成熟樹狀細胞形態之影響-28 二、檳榔萃取物及檳榔鹼對人類未成熟樹狀細胞代謝活性影響之檢測-28 第四節、檳榔萃取物及檳榔鹼對人類未成熟樹狀細胞反應性的影響 一、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）預先處理對脂多醣（LPS）刺激下之人類未成熟樹狀細胞形態及表面抗原表現的影響-29 二、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）預先處理對脂多醣（LPS）刺激下之人類未成熟樹狀細胞表現IL-12B mRNA的影響-30 第五章、討論 第一節、人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞的實驗模式建立-50 第二節、檳榔萃取物（ANE）和檳榔鹼（AR）對樹狀細胞分化之影響-51 第三節、檳榔萃取物和檳榔鹼對樹狀細胞代謝活性之影響-53 第四節、檳榔萃取物和檳榔鹼對樹狀細胞反應性之影響-55 第六章、結論-58 誌謝-59 參考文獻-60 表次 表一、人類未成熟樹狀細胞表面抗原表現之百分比與強度-.33 表二、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於細胞表面抗原表現之影響-38 表三、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於全體細胞表面抗原之影響-39 表四、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）預先處理對脂多醣（LPS）刺激下之人類未成熟樹狀細胞表面抗原表現之影響-48 圖次 圖一、人類未成熟樹狀細胞表面抗原之表現-32 圖二、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀於細胞形態之影響-34 圖三、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於細胞濃度及存活率之影響-35 圖四、檳榔萃取物（ANE）對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於細胞表面抗原表現之影響-36 圖五、檳榔鹼（AR）對人類周邊血液單核球分化為未成熟樹狀細胞於細胞表面抗原表現之影響-37 圖六、檳榔萃取物（ANE）對人類未成熟樹狀細胞形態之影響-40 圖七、檳榔鹼（AR）對人類未成熟樹狀細胞形態之影響-41 圖八、檳榔萃取物（ANE）對人類未成熟樹狀細胞代謝活性之影響-42 圖九、檳榔鹼（AR）對人類未成熟樹狀細胞代謝活性之影響-43 圖十、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）對人類未成熟樹狀細胞代謝活性之影響-44 圖十一、檳榔萃取物（ANE）及檳榔鹼（AR）預先處理對脂多醣（LPS）刺激下之人類未成熟樹狀細胞形態之影響-45 圖十二、檳榔萃取物（ANE）預先處理對脂多醣（LPS）刺激下之人類未成熟樹狀細胞表面抗原表現之影響-46 圖十三、檳榔鹼（AR）預先處理對脂多醣（LPS）刺激下之人類未成熟樹狀細胞表面抗原表現之影響-47 圖十四、檳榔萃取物（ANE）預先處理對脂多醣（LPS）刺激下人類未成熟樹狀細胞表現IL-12B mRNA之影響-48 圖十五、檳榔鹼（AR）預先處理對脂多醣（LPS）刺激下人類未成熟樹狀細胞表現IL-12B mRNA之影響-491209619 bytesapplication/pdfen-US檳榔萃取物樹狀細胞成熟檳榔鹼脂多醣免疫調控分化介白素-12areca nut extractinterleukin-12dendritic celldifferentiationlipopolysaccridematurationarecolineimmunomodulationthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/60019/1/ntu-93-R87629019-1.pdf