游若篍臺灣大學：食品科技研究所邱佩娟Chyou, Pei-JiuanPei-JiuanChyou2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56359摘要 人體腸道菌相十分複雜，其中有益菌雙叉桿菌(bifidobacteria)與有害菌產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)菌數的消長，與人體健康關係十分密切。本試驗探討攝食雙叉桿菌鮮乳在四週的試驗期間對24位健康成人腸道菌相、糞便水份含量、pH值及其萃取液對細胞毒性之影響。試驗分成四個時期，第一期為飲食調整期，第二、三期為攝食雙叉桿菌鮮乳的前期與後期，第四期為排空期。另外再進行二十天之雙叉桿菌鮮乳儲存安定性試驗，探討在一般的儲存溫度與運送過程溫度變動下，對雙叉桿菌鮮乳品質的影響。 結果顯示，攝食雙叉桿菌鮮乳可使受試者腸道中雙叉桿菌顯著增加(p < 0.05)；而腸道有害菌產氣莢膜梭菌顯著減少(p < 0.05)。試驗期間受試者糞便檢體的水分含量、pH值無統計上的差異，且受試者的身高、體重、BMI值及血液生化值均無顯著變化，皆在標準範圍內(p > 0.05)。 接著以MTT細胞存活分析法，測定糞便檢體萃取液對腸道細胞株Caco-2及HT-29之細胞毒性。結果顯示，低濃度之糞便檢體萃取液對腸道細胞不具毒性，在雙叉桿菌鮮乳攝食期間，可顯著降低高濃度糞便檢體萃取液對腸道細胞的毒性(p < 0.05)。顯示攝食雙叉桿菌鮮乳，不會對受試者生理上造成不良的影響。可有效增加腸道益菌數，減少害菌數，並降低糞便中毒性物質對腸道細胞的傷害，具改善腸道健康之功能。 雙叉桿菌鮮乳儲存安定性試驗結果顯示，含菌量6.63 log CFU/mL之雙叉桿菌鮮乳，在一般鮮乳十天之保存期限內，儲存溫度不論是在4℃或11℃，其雙叉桿菌活菌數皆大於6.2 log CFU/mL，pH值維持在6.7-6.8，可滴定酸度為0.1%，皆正常範圍之內，在保存期間生化特性穩定，品質安定。Abstract The human gastrointestinal is a complex ecosystem, the balance of beneficial bacteria bifidobacteria and harmful Clostridium perfringens is highly related to human health. This study was conducted to investigate the effect of intake fresh milk plus Bifido® on the intestinal microflora, fecal water content, pH values and fecal extracts cytotoxicity on Caco-2 and HT-29 in 24 healthy adults. Furthermore, the changes of viable bifidobacteria, pH value and titratable acidity in fresh milk plus Bifido® store at 4℃ and 11℃ for 20 days were also studied. Results indicated that intake the fresh milk plus Bifido® significantly increased the colony counts of fecal bifidobacteria (p < 0.05), decreased the growth of C. perfringens (p < 0.05) and significantly increased the log number ratio of bifidobacteria to C. perfringens (p < 0.05). Subjects’ height, weight, BMI, blood parameters, fecal water content and fecal pH had no apparent changes during experimental period. Each period of subjects’ fecal extracts at low concentrations were no cytotoxicity on Caco-2 and HT-29. The cytotoxicity of subjects’ fecal extracts at high concentrations on Caco-2 and HT-29 were significantly reduced during fresh milk plus Bifido® intake periods (p < 0.05). These results suggested that intake the fresh milk plus Bifido® were beneficial in improving the intestinal flora and decreasing cytotoxic materials in the intestinal tract of health adults. Fresh milk plus Bifido® contains 6.63 log CFU/mL bifidobacteria. The survival number of bifidobacteria in fresh milk plus Bifido® was maintained at 6.2 log CFU/mL during 10 days of shelf life time. The changes of pH value and titratable acidity in fresh milk plus Bifido® did not change statistically during the experimental period (p > 0.05).目 錄 頁次 第一章 總論..………………………………………………… 1 壹、 前言…………………………………………………… 1 貳、 文獻整理……………………………………………… 2 一、 人體消化道菌群分佈………………………………… 2 （一） 腸道菌相之簡介……………………………………… 2 （二） 影響腸道菌相之因素………………………………… 7 二、 腸道菌相與健康……………………………………… 9 （一） 腸道菌相的功效……………………………………… 9 （二） 腸內物質的組成……………………………………… 10 （三） 腸道細菌代謝造成的毒性影響……………………… 13 （四） 測定大腸功能的方法………………………………… 19 三、 益生菌之簡介………………………………………… 22 （一） 雙叉桿菌的介紹……………………………………… 22 （二） 雙叉桿菌之營養機能及健康功效………………………24 第二章 攝食雙叉桿菌鮮乳對腸道菌相與Caco-2及HT-29毒性 之影響………29 壹、 實驗架構……………………………………………… 29 貳、 材料與方法…………………………………………… 33 一、 實驗材料……………………………………………… 33 （一） 雙叉桿菌鮮乳………………………………………… 33 （二） 藥品…………………………………………………… 33 （三） 器材…………………………………………………… 33 （四） 試驗細胞株…………………………………………… 34 （五） 培養基………………………………………………… 34 二、 人體試驗之設計……………………………………… 35 （一） 受試者………………………………………………… 35 （二） 試驗設計…………………………………………………35 （三） 飲食控制與飲食記錄………………………………… 36 三、 人體試驗之方法……………………………………… 36 （一） 培養基………………………………………………… 36 （二） 取樣及微生物檢測…………………………………… 37 （三） 水分含量……………………………………………… 38 （四） pH測定……………………………………………………38 四、 糞便檢體萃取液細胞毒性試驗之方法…………………38 （一） 製備培養基…………………………………………… 38 （二） 細胞的解凍活化……………………………………… 38 （三） 細胞培養……………………………………………… 38 （四） 細胞繼代……………………………………………… 39 （五） 細胞株的保存………………………………………… 39 （六） 細胞數計數…………………………………………… 39 （七） 糞便檢體萃取液之製備……………………………… 40 （八） 糞便檢體萃取液對人類結腸癌細胞株Caco-2及HT-29之毒 性試驗… 40 五、 統計分析……………………………………………… 41 參、 結果與討論…………………………………………… 41 一、 試驗期間受試者血液生化值及每日營養素平均攝取量 ……………41 二、 攝食雙叉桿菌鮮乳對受試者糞便中雙叉桿菌之影 響…………42 三、 攝食雙叉桿菌鮮乳對受試者糞便中產氣莢膜梭菌之 影響………43 四、 攝食雙叉桿菌鮮乳對受試者糞便中雙叉桿菌及產氣莢膜梭 菌菌數對數比值之影響……………………………… 44 五、 攝食雙叉桿菌鮮乳對受試者糞便水分含量及pH值之影 響……………44 六、 攝食雙叉桿菌鮮乳之受試者糞便檢體萃取液對Caco-2及 HT-29細胞毒性試驗………………………………………44 肆、 結論…………………………………………………… 46 第三章 雙叉桿菌鮮乳儲存安定性試驗……………………… 62 壹、 實驗架構……………………………………………… 65 貳、 材料與方法…………………………………………… 64 一、 實驗材料……………………………………………… 64 （一） 雙叉桿菌鮮乳………………………………………… 64 （二） 器材…………………………………………………… 64 二、 培養基………………………………………………… 64 三、 實驗方法……………………………………………… 64 （一） 雙叉桿菌鮮乳之雙叉桿菌數測定…………………… 64 （二） 雙叉桿菌鮮乳pH值之測定………………………………65 （三） 雙叉桿菌鮮乳酸度之測定…………………………… 65 四、 統計分析……………………………………………… 65 參、 結果與討論…………………………………………… 65 一、 雙叉桿菌鮮乳之雙叉桿菌菌數變化情形…………… 65 二、 雙叉桿菌鮮乳之pH值及酸度變化情形……………… 66 肆、 結論…………………………………………………… 66 參考文獻…………………………………………………………… 70 附錄………………………………………………………………… 85 附錄一、 受試者基本資料……………………………………… 85 附錄二、 糞便性質問卷................................. 86 附錄三、 飲食習慣問卷................................. 88 附錄四、 實驗後測問卷………………………………………… 89 附錄五、 飲食紀錄範例............................... 91 附錄六、 臺灣保健食品學會同意臨床試驗證明書-雙叉桿菌鮮乳 (中文)……………… 92 附錄七、 臺灣保健食品學會同意臨床試驗證明書-雙叉桿菌鮮乳 (英文)……………… 932404724 bytesapplication/pdfen-US腸道菌相雙叉桿菌產氣莢膜梭菌細胞毒性存活率Intestinal florabifidobacteriaClostridium perfringensCytotoxicityViability[SDGs]SDG3thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56359/1/ntu-96-R94641005-1.pdf