闕玲玲臺灣大學：獸醫學研究所黃瓊儀Huang, Chiung-YiChiung-YiHuang2007-11-282018-07-092007-11-282018-07-092006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/59966犬傳染性呼吸道疾病 (canine infectious respiratory disease) 是狗的呼吸道感染症之統稱，目前已知可引起CIRD的病原涵蓋了病毒與細菌兩大類，在病毒的部份主要有犬瘟熱病毒 (canine distemper virus, CDV)、犬第二型副黏液病毒 (canine parainfluenza virus type 2, CPIV-2)、犬疱疹病毒 (canine herpesvirus, CHV)、犬第一型與第二型腺病毒 (canine adenovirus type 1 and type 2；CAV-1 and CAV-2)，以及 (canine respiratory coronavirus；CRCoV) 等。以RT-nPCR / n-PCR為基礎的特異性核酸診斷技術，針對臨床54個家犬病例的進行偵測，檢出率依序為：CDV 41 %、CAV-2 28 %、CPIV-2 13 %、CRCoV 8 % 以及CHV 4 %。偵測到的混合感染型式有CDV和CPIV-2 (9 %)、CDV和CAV-2 (7 %)、CAV-2和CPIV-2 (4 %)，以及CDV和CHV (2 %)、CAV-2、CHV與CRCoV (2 %)、CDV、CAV-2與CRCoV (2 %)。多重檢體偵測的結果以鼻腔、口腔、眼結膜拭子的平均檢出率較高，血液則最差。將核酸診斷所增幅出的陽性產物片段進行定序分析，本土株之間的相似度為98.7 – 100 %，與GenBank中已發表的國外毒株基因序列比對後的相似度為95 – 100 %，在CRCoV、CPIV-2、CHV的數個核苷酸變異可供區別本土株與國外毒株。在病毒感染與臨床症狀的統計分析，證實任一種呼吸道病毒感染會使上呼吸道症狀變得更嚴重 (P < 0.01)，尤其是單純CAV感染 (P < 0.05)、CDV單純與混合感染 (P < 0.05)，以及CAV單純和其他病毒混合感染 (P < 0.01)；任一種呼吸道病毒感染會使患犬出現化膿性鼻分泌物的情形增加 (P < 0.01)，尤其是牽涉到CDV與CAV的感染會使得上呼吸道二次性細菌感染的機率提高 (P < 0.05)。在呼吸道病例中，CAV和CPIV混合感染以及CDV所有的混合感染型式 (不包括單純感染) 會使得患犬嘔吐的情形增加 (P < 0.05)。在呼吸道病例中，無論是CDV的單純或混合感染，皆會使得患犬下痢症狀出現的情形增加 (P < 0.01)。Canine infectious respiratory disease (CIRD) is a general call of respiratory infections in dogs. Several studies of natural outbreaks of the disease have shown that the etiology is complex, with a variety of viruses and bacteria involved. The viruses that have been most frequently reported to be present are canine distemper virus (CDV), canine adenovirus type 1 and type 2 (CAV-1 and CAV-2), canine herpesvirus (CHV), canine parainfluenza virus type 2 (CPIV-2), and canine respiratory coronavirus (CRCoV). We detected these viruses from clinical samples of 54 cases with specific nucleic acid diagnostic assays based on RT-nPCR / n-PCR, and obtained the detection rates as follows: CDV: 41 %; CAV-2: 28 %; CPIV-2: 13 %; CRCoV: 8 %; CHV: 4 %. A population of dogs (26%) had evidence of infections with several viruses at the same time. The coinfection patterns are: CDV with CPIV-2 (9 %), CDV with CAV-2 (7 %), CAV-2 with CPIV-2 (4 %), and CDV with CHV (2 %). The infectious patterns involved with three viruses including: CAV-2, CHV and CRCoV (2 %); CDV, CAV-2 and CRCoV (2 %). Generally speaking, detection rates of nasal swab, oral swab and conjunctival swab have a elevation compared with whole blood. The gene sequence results of the RT-nPCR and n-PCR products of representative positive samples showed 98.7 – 100% nucleotide identity with corresponding viral gene and 95 – 100% with foreign strains. The nucleotides variation in CRCoV, CPIV-2, and CHV can be differentiated local strains form foreign strains. According to the statistical analysis results, any infectious pattern of these virus showed a significant variability with the severity of upper respiratory symptoms (P < 0.01), and higher variability in secondary bacterial infections (P < 0.01). In some particular viral infections showed a significant variability with the clinical sign of vomiting and diarrhea (P < 0.05)目錄 I 圖次 IV 表次 V 中文摘要 VI 英文摘要 VII 第一章 研究動機與目的 1 第二章 文獻回顧 2 第一節 犬傳染性呼吸道疾病 2 第二節 各病毒介紹 4 2.2.1. 犬呼吸道型冠狀病毒 4 2.2.1.1. 犬呼吸道型冠狀病毒之研究歷史背景 4 2.2.1.2. 犬呼吸道型冠狀病毒之特徵與基因體特性 6 2.2.1.3. 犬呼吸道型冠狀病毒之流行病學 7 2.2.1.4. 犬呼吸道型冠狀病毒之致病機轉與臨床症狀 8 2.2.2. 犬副黏液病毒 9 2.2.2.1. 犬副黏液病毒之研究歷史背景 9 2.2.2.2. 犬副黏液病毒之特徵與基因體特性 9 2.2.2.3. 犬副黏液病毒之流行病學 10 2.2.2.4. 犬副黏液病毒之致病機轉與臨床症狀 10 2.2.3. 犬疱疹病毒 11 2.2.3.1. 犬疱疹病毒之研究歷史背景 11 2.2.3.2. 犬疱疹病毒之特徵與基因體特性 11 2.2.3.3. 犬疱疹病毒之流行病學 13 2.2.3.4. 犬疱疹病毒之致病機轉與臨床症狀 13 2.2.4. 犬腺病毒 14 2.2.4.1. 犬腺病毒之研究歷史背景 14 2.2.4.2. 犬腺病毒之特徵與基因體特性 15 2.2.4.3. 犬腺病毒之流行病學 15 2.2.4.4. 犬腺病毒之致病機轉與臨床症狀 16 2.2.5. 犬瘟熱 17 2.2.5.1. 犬瘟熱病毒之研究歷史背景 17 2.2.5.2. 犬瘟熱病毒之特徵與基因體特性 17 2.2.5.3. 犬瘟熱病毒之流行病學 18 2.2.5.4. 犬瘟熱病毒之致病機轉與臨床症狀 19 第三章 材料與方法 21 第一節 實驗設計 21 3.1.1. 特異性病毒核酸診斷技術的建立 21 3.1.2. 了解臨床CIRD病例中各病毒感染的情形 22 第二節 實驗材料與方法 23 3.2.1. 檢體來源 23 3.2.1.1. 檢體之處理 23 3.2.1.1.1.血液 23 3.2.1.1.2.各種拭子 (鼻腔、眼結膜、口腔、肛門) 24 3.2.1.1.3.尿液、糞便與其他檢體 24 3.2.2. 陽性對照病毒來源 24 3.2.3. 寡核苷酸引子之選擇與設計 24 3.2.3.1. 犬呼吸道型冠狀病毒 25 3.2.3.2. 犬黏液感病毒 26 3.2.3.3. 犬疱疹病毒 26 3.2.3.4. 犬腺病毒 27 3.2.3.5. 犬瘟熱病毒 28 3.2.4. 核酸萃取 28 3.2.4.1. 病毒RNA萃取 28 3.2.4.2. 病毒DNA萃取 29 3.2.5. 偵測病毒核酸的結果與判讀 30 3.2.5.1. 反轉錄反應 (reverse transcription, RT) 30 3.2.5.2. 聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR) 31 3.2.5.3. 巢式聚合酶鏈反應 (nested polymerase chain reaction, n-PCR) 32 3.2.5.4. 限制酵素片段長度多型性 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 34 3.2.5.5. 以電泳分析反應結果 34 3.2.5.6. 陽性病例之判讀 35 3.2.5.7. 序列分析與比對 35 3.2.6. 統計分析檢測結果 36 第四章 結果 37 第一節 各病毒的核酸檢測結果與定序分析 37 4.1.1. 犬呼吸道型冠狀病毒 37 4.1.1.1. 犬呼吸道型冠狀病毒核酸檢測結果 37 4.1.1.2. 犬呼吸道型冠狀病毒序列分析結果 39 4.1.2. 犬副流感病毒 40 4.1.2.1. 犬副流感病毒核酸檢測結果 40 4.1.2.2. 犬副流感病毒序列分析結果 41 4.1.3. 犬疱疹病毒 44 4.1.3.1. 犬疱疹病毒核酸檢測結果 44 4.1.3.2. 犬疱疹病毒序列分析結果 45 4.1.4. 犬腺病毒 47 4.1.4.1. 犬腺病毒核酸檢測結果 47 4.1.4.2. 犬腺病毒序列分析結果 51 4.1.5. 犬瘟熱病毒 53 4.1.5.1. 犬瘟熱病毒核酸檢測結果 53 4.1.6. 核酸診斷檢出效果的分析 55 4.1.7. 各病毒單純與混合感染的情形 56 第二節 檢測結果與臨床症狀的關係 56 4.2.1. 眼睛的症狀與呼吸道病毒感染的關係 58 4.2.2. 上呼吸道症狀與呼吸道病毒感染的關係 58 4.2.3. 出現化膿性鼻分泌物與呼吸道病毒感染的關係 58 4.2.4. 下呼吸道症狀與呼吸道病毒感染的關係 58 4.2.5. 嘔吐與呼吸道病毒感染的關係 59 4.2.6. 下痢與呼吸道病毒感染的關係 59 第五章 討論 60 參考文獻 67 附錄 74 附錄一 病毒感染與臨床症狀差異分析過程的符號對照表 74 附錄二 使用Fisher's exact test分析病毒感染與臨床症狀的結果 751453088 bytesapplication/pdfen-US犬傳染性呼吸道疾病canine infectious respiratory disease[SDGs]SDG3thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/59966/1/ntu-95-R93629004-1.pdf