陳媺玫臺灣大學：獸醫學研究所徐達Shih, DaDaShih2007-11-282018-07-092007-11-282018-07-092007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/59971錦鯉疱疹病毒 (koi herpes virus；KHV)，目前被分類為鯉科疱疹病毒的第三類 (Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)。是一種會引起錦鯉 (Cyprinus carpio koi) 及鯉魚 (Cyprinus carpio carpio) 急性死亡的病毒。KHV自1998年發生於以色列，之後許多國家的錦鯉及鯉魚養殖場也陸續爆發本病。KHV能夠快速的在各國間傳播可能是藉由錦鯉魚的買賣，而台灣也在2002年12月確定成為疫區。由於本病傳播速度快、死亡率高且目前還沒有任何治療方法，所以如何預防及阻斷本病的傳播成為當前最重要的課題。本實驗室針對一般錦鯉養殖池內會出現的生物進行同居感染試驗，以期找出KHV在環境中的傳播途徑。同居試驗生物包括金魚、朱文錦、虎皮蛙、大肚魚、黑殼蝦及石螺，檢測方法採用胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase, TK) 片段基因的聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)。結果顯示金魚、朱文錦、虎皮蛙及大肚魚皆可在與發病錦鯉共同飼養三天後於體表檢測出陽性結果。進一步將這些生物與健康錦鯉共同飼養後，自第三天起便可在錦鯉鰓部檢測出陽性反應，並使部分健康錦鯉魚發病死亡。但是在原位雜交後的結果顯示僅有金魚可以在其體內觀察到陽性訊號，而陽性訊號主要出現在腎臟、脾臟及腸道之巨噬細胞內。所以由本實驗可知，金魚可以感染KHV而不發病，為其保毒者 (reservoir)，而朱文錦、虎皮蛙及大肚魚則僅能機械性攜帶本病毒。Koi herpes virus (KHV), tentatively categorized under the family Herpesviridae as the novel designation Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3), is an emerging virus which causes fatal disease in koi (Cyprinus carpio koi) and common carps (Cyprinus carpio carpio). In 1998 many carp and koi farms were found to be afflicted by KHV with a high mortality in Israel. Since then, the same disease has been identified in many carp farms in different countries. The rapid spread of the disease is suggested due to the intensive worldwide trade of koi, and Taiwan has been identified to be an infected zone since December 2002. Because of the high mortality, rapid spread, and deficiency of effective therapies, how to prevent and disrupt its transmission pathway becomes the most important thing now. In order to find the KHV transmission vectors in the field, we developed some cohabitation experiments to mimic the natural transmission of KHV in koi farms. The commonly-found aquatic animals in koi farms involved in the cohabitation experiments include the goldfish, common goldfish, Chinese bull frog, mosquito fish, shrimp and snail. Our results revealed that the goldfish, common goldfish, Chinese bull frog and mosquito fish showed KHV positive by the PCR method after cohabiting three days with the KHV infected koi. Those KHV-positive creatures further cohabited with the normal koi, which were examined and proved to be KHV positive three days latter. However, the positive signal could only be found in goldfish visceral organs including kidney, spleen and intestine by in situ hybridization. Taken together, we concluded that the goldfish is the potential reservoir of KHV, and the common goldfish, Chinese bull frog and mosquito fish could just play a mechanical vector carrying the virus on their body surface.目錄 目錄……………………………………………………………………………………I 表次…………………………………………………………………………………..IV 圖次…………………………………………………………………………………...V 中文摘要……………………………………………………………………………..VI 英文摘要……………………………………………………………………………VII 第一章 緒論………………………………………………………………………….1 第二章 文獻回顧…………………………………………………………………….3 第一節 魚類疱疹病毒科之簡介……………………………………………….3 第二節 鯉魚疱疹病毒之簡介…………………………………...……………...4 2-1 第一型鯉魚疱疹病毒…………………………………………………….4 2-1-1 生化特性……………….……………………………………………5 2-1-2 診斷方法……….……………………………………………………6 2-1-3 治療……….…………………………………………………………6 2-2 第二型鯉魚疱疹病毒…………...………………………………………..6 2-2-1 生化特性……...……..………………………………………………7 2-2-2 剖檢及組織顯微病變………….……………………………………7 2-2-3 診斷方法….…………………………………………………………7 2-2-4 治療及控制…….……………………………………………………8 2-3 第三型鯉魚疱疹病毒…………...………………………………………..8 2-3-1 分類………….………………………………………………………9 2-3-2 流行病學………………………………………………………….....9 2-3-3 臨床症狀………...…………………………………………………10 2-3-4 剖檢及組織顯微病變……………...………………………………11 2-3-5 潛伏感染及再發………………………………………………...…11 2-3-6 診斷方法...…………………………………………………………11 2-3-7 治療...................................................................................................13 2-3-8 疫苗…………….…………………………………………………..13 2-3-9 飼養管理…….…………………………………………………......14 2-3-10 檢疫………...……………………………………………………..14 第三章 實驗材料與方法……………………………………………………………15 第一節 實驗流程………………………………………………………………15 第二節 實驗材料………………………………………………………………16 2-1 去氧核糖核酸(DNA)之萃取………...…………………………………16 2-2 聚合酶鏈鎖反應………...………………………………………………16 2-3 瓊脂醣凝膠電泳………...………………………………………………16 2-4 實驗動物………………………………………...………………………17 2-5 細胞株………...…………………………………………………………18 2-6 細胞用培養液……………………...……………………………………18 2-7 原位雜交…………………...……………………………………………19 第三節 實驗方法……..…..……………………………………………………21 3-1 KHV去氧核糖核酸(DNA)之萃取….…………………………………..21 3-2 聚合酶鏈鎖反應………...………………………………………………21 3-3 瓊脂醣凝膠電泳……………...…………………………………………22 3-4 核酸定序及序列比對…………………………………………...………22 3-5 KHV乳劑之製備………………………………………………………..23 3-6 實驗室病毒接種………...………………………………………………23 3-7 同居感染試驗…………...………………………………………………23 3-8 病毒分離………...………………………………………………………23 3-9 免疫膜點法………...……………………………………………………24 3-10 原位雜交……….………………………………………………………25 第四章 實驗結果……………………………………………………………………26 第一節 錦鯉泡疹病毒之病毒分離……………………………………………26 第二節 實驗室人工接種錦鯉泡疹病毒………………………………………26 第三節 同居感染試驗…………………………………………………………27 第四節 KHV探針製備結果…………………………………………………...28 第五節 原位雜交……………………………………………………………....28 第五章 討論………………………………………………………………………....40 第六章 參考文獻…………………………………………………………………....49 表次 表一 實驗室病毒接種結果………………………………………………………30 表二 同居試驗結果………………………………………………………………30 圖次 圖一 PCR檢測KHV之洋菜膠片電泳…………………………………………31 圖二A 錦鯉鰓細胞株(KG cell line)之細胞變化……………………………….....31 圖二B 正常之細胞株……………………………………………………………...31 圖三 PCR檢測細胞及培養液之洋菜膠片電泳……………..………………...31 圖四A PCR檢測乳劑組接種KHV之洋菜膠片電泳……………………………31 圖四B PCR檢測KG cell組接種KHV之洋菜膠片電泳………………………..31 圖五 接種KHV後魚隻外觀……………………………………………………..31 圖六 PCR檢測同居實驗缸內池水之洋菜膠片電泳…………………………..32 圖七 PCR檢測同居實驗缸內布袋蓮葉片之洋菜膠片電泳…………………..33 圖八 PCR檢測同居實驗缸內金魚魚鰓之洋菜膠片電泳……………………..33 圖九 PCR檢測與金魚同居實驗之健康錦鯉魚鰓之洋菜膠片電泳…………..34 圖十 PCR檢測同居實驗缸內朱文錦魚鰓之洋菜膠片電泳…………………..34 圖十一 PCR檢測與朱文錦同居實驗之健康錦鯉魚鰓之洋菜膠片電泳……..34 圖十二 PCR檢測同居實驗缸內虎皮蛙體表黏液之洋菜膠片電泳……………..35 圖十三 PCR檢測與虎皮蛙同居實驗之健康錦鯉魚鰓之洋菜膠片電泳………..35 圖十四 PCR檢測同居實驗缸內大肚魚內臟之洋菜膠片電泳…………………..35 圖十五 PCR檢測與大肚魚同居實驗之健康錦鯉魚鰓之洋菜膠片電泳………..36 圖十六 KHV PCR產物上標定DIG之洋菜膠片電泳……………………………36 圖十七 免疫膜點法………………………………………………………………..36 圖十八 針對錦鯉組織進行原位雜交結果………………………………………..37 圖十九 針對金魚腸道組織進行原位雜交結果…………………………………..37 圖二十 針對金魚脾臟組織進行原位雜交結果…………………………………..38 圖二十一 針對金魚腎臟組織進行原位雜交結果………………………………..38 圖二十二 針對金魚腦及鰓部組織進行原位雜交結果…………………………..391892135 bytesapplication/pdfen-US錦鯉疱疹病毒錦鯉疱傳播途徑koikoi herpesvirusherpesvirusCyHV-1thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/59971/1/ntu-96-R93629012-1.pdf