邱式鴻臺灣大學：生化科學研究所謝孟穎Hsieh, Meng-YinMeng-YinHsieh2007-11-262018-07-062007-11-262018-07-062004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/52779小熱休克蛋白家族為一種在生物體內含量豐富且普遍存在的逆境壓力刺激蛋白。此家族的成員其單元體介於 12∼45 kDa，並可形成分子量 200∼800 kDa的聚合體。小熱休克蛋白（sHSPs）的序列同源性並不大，但它們在C端有一段保守性區域，稱為 α-水晶體蛋白保守區域，約為 80∼100 個胺基酸；而在N端及C末端延伸區，其胺基酸序列及長度則有很大的變異性。 線蟲的基因體計畫已於 1998 年完成，它是第一個基因體序列被完全定出來的多細胞生物。相較於原核生物，線蟲與多細胞真核生物之基因序列有較高的同源性。因此，我們以線蟲的小熱休克蛋白為在實驗材料，進行本論文之研究。 此論文研究之目的在於探討線蟲中小熱休克蛋白 sHSP12.2 與 sHSP12.3 的基本物化特性以及是否具有分子保護活性，並作分析比較。以分析級超高速離心及交叉連結實驗得知 sHSP12.2 與 12.3 皆為四聚體的蛋白；在熱穩定度上，sHSP12.3 (Tm＞90℃) 較 sHSP12.2 (Tm＝62℃) 穩定。在二級結構上主要以 β-摺板構成，並會隨著環境溫度的提高而使結構變成不規則構形，而此現象也伴隨著內在及外在螢光光譜訊號強度的減弱，其代表著色胺酸殘基在水溶液的暴露性增加。這些二、三級結構上的改變可能是 sHSP12.2 與 12.3 原本就很弱的分子保護者活性消失，及其受質蛋白質產生變性沈澱的主因。此現象與以前研究之小熱休克蛋白在預熱狀態下會增加分子保護者活性的特性不同。另外，進一步以二維電泳及 MALDI-TOF 質譜方法找到加熱逆境刺激下所產生的 sHSP12.2 和 12.3 兩種目標蛋白。這兩個特異的線蟲小熱休克蛋白之生理功能是未來的研究方向。Small heat shock proteins (sHSPs) represent an abundant and ubiquitous family of stress proteins. The proteins range in size from 12 to 45 kDa and are found as large complexes of 200-800 kDa. sHSPs show little sequence homology. The homology is only restricted to the evolutionarily conserved region termed the ‘目錄 Ⅰ 縮寫表 Ⅱ 中文摘要 Ⅲ ABSTRACT Ⅳ 第一章 序論 1 1.1 小熱休克蛋白 2 1.2 線蟲 6 1.3 線蟲之小熱休克蛋白 8 1.4 研究動機與目的 9 圖表 10 第二章 材料與方法 19 2.1 實驗材料 20 2.2 實驗藥品試劑 21 2.3 實驗儀器設備 23 2.4 實驗方法 24 圖表 33 第三章 結果與討論 35 3.1 線蟲小熱休克蛋白sHSP12.2與sHSP12.3基因之選殖 36 3.2 線蟲小熱休克蛋白sHSP12.2與sHSP12.3之表現、純化與鑑定 39 3.3 sHSP12.2與sHSP12.3 之基本性質鑑定 42 3.4 sHSP12.2與sHSP12.3 之分子保護者活性鑑定 46 3.5 線蟲於熱壓力下之二維電泳 51 圖表 52 第四章 結論與展望 95 4.1 結論 96 4.2 未來展望 97 參考文獻 98en-US小熱休克蛋白線蟲分子保護活性chaperone activityCaenorhabditis eleganssmall heat rptoeinsother