王重雄臺灣大學：昆蟲學研究所林光宏Lin, Kuang-HungKuang-HungLin2007-11-262018-06-292007-11-262018-06-292006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/55070利用次選殖（sub-clone）技術從舞毒蛾 IPLB-LD652Y 母細胞株選殖出 IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7、IPLB-LD652Y-b、IPLB-LD652Y-d、IPLB-LD652Y-f、IPLB-LD652Y-g、及IPLB-LD652Y-h 共 7 株次選殖株。此 7 株次選殖株與母株在形態上皆可以區分為四型：圓形、鱗狀、梭狀及多形態細胞，其中以圓形細胞所佔之比例為最高。黑角舞蛾核多角體病毒（LyxyNPV）感受性試驗結果，顯示對照組 SL-7B 細胞株對各株供試病毒（Ly5、LyxyExp-DsRed、LyxyExp-EGFP） 均無感受性；而陽性對照組 NTU-LY 系列細胞株則對各株供試病毒均呈現高感受性。至於 IPLB-LD652Y 系列細胞株對 Ly5 皆具高感受性，但對 LyxyExp-DsRed 則均呈現低感受性；對 LyxyExp-EGFP 之感受性除 IPLB-LD652Y-h 較低外，其餘各株均呈現高感受性。依產 Ly5 胞外病毒能力，選出產量高的 3 株次選殖株（IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7 及 IPLB-LD652Y-f）與其母株作進一步細胞特性之探討。選出之 3 株次選殖細胞株之生長速率均顯著高於母株，而 IPLB-LD652Y-f 又顯著高於 IPLB-LD652Y-5。染色體數分析結果顯示這 4 株細胞株染色體數分布皆很相近，其平均值介於 78.02 至 87.28。同功異構酶分析顯示 IPLB-LD652Y、IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7 及 IPLB-LD652Y-f 皆有相同的 EST Esterase （EST） 、 Malate dehydrogenase ( MDH ) 及 Lactate dehydrogenase ( LDH ) 電泳圖譜，且明顯不同於 NTU-LY1 的電泳圖譜。ITS （Internal transcribed spacer） 序列分析顯示 IPLB-LD652Y、IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7 及 IPLB-LD652Y-f 細胞株之 ITS 片段序列並無任何差異。感染 LyxyExp-EGFP 後之 EGFP 相對螢光分析顯示出4 株細胞株 （IPLB-LD652Y、IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7 及 IPLB-LD652Y-f） 之 EGFP 相對螢光值，隨著感染時間的增加會有明顯的改變。綜合以上結果可篩選出對 LyxyMNPV 感受性、產量最高及生長速率快之IPLB-LD652Y-7細胞株。Seven new cell lines, IPLB-LD652Y-5, IPLB-LD652Y-7, IPLB-LD652Y-b, IPLB-LD652Y-d, IPLB-LD652Y-f, and IPLB-LD652Y-h, have been sub-cloned from the parental cell line, IPLB-LD652Y. There were four kinds of cell shape within these cell lines including round, squamous, spindle, and polymorphous shape. Among them, the round shape cells were the most preponderant. According to the virus infection results, SL-7B cannot been infected with Ly5, LyxyExp-DsRed, and LyxyExp-EGFP while the NTU-LY cell lines had high susceptibility with the same viruses infection. Moreover, the IPLB-LD652Y and subcloned cell lines showed similar results as the NTU-LY cell lines, but them showed lower susceptibility when infected with LyxyExp-DsRed, and only IPLB-LD652Y-h had lower susceptibility when infected with LyxyExp-EGFP. According to the results, we chose three sub-clonal cell lines with high production of Ly5 virus, IPLB-LD652Y-5, IPLB-LD652Y-7, and IPLB-LD652Y-f for the further comparison with the parental cell line. We can observe that the chosen cell lines have higher growth rate than the parental cell line, and the growth rate of IPLB-LD652Y-f were higher than that of IPLB-LD652Y-5.The distribution of chromosome numbers of these four cell lines were very close, between 78.02 to 87.28. In the result of isozyme, whether on EST Esterase （EST）、 Malate dehydrogenase ( MDH ) or Lactate dehydrogenase ( LDH ), the electrophoresis patterns of the chose cell lines were all the same and significant different from that of the NTU-LY1. The ITS （Internal transcribed spacer） sequences of the four cell lines, and they showed no significant difference. In the relative fluorescent unit (RFU) comparison, significant curve growth and decline with the increasing with the time post LyxyExp-EGFP inoculation were observed. Integrating the results, the IPLB-LD652Y-7 could be sifted as the highest virus susceptibility, production, and speedy growth cell line when infected with LyxyMNPV.i 目錄 中文摘要………………………………………………………………………………1 英文摘要………………………………………………………………………………2 壹、緒言………………………………………………………………………………3 貳、往昔研究…………………………………………………………………………5 一、舞毒蛾與木毒蛾背景簡介…………………………………………………5 二、核多角體病毒簡介……………………………………………………6 三、昆蟲細胞培養之發展…………………………………………………9 四、細胞株之選殖…………………………………………………………11 五、細胞株之特性與鑑定…………………………………………………11 六、螢光蛋白基因的發現與應用…………………………………………13 參、材料與方法………………………………………………………………………15 一、供試細胞株…………………………………………………………………15 二、供試病毒株…………………………………………………………………15 三、母株之次選殖………………………………………………………………15 四、細胞之冰凍保存與解凍培養………………………………………………16 五、胞外病毒效價測定…………………………………………………………16 六、次選殖細胞株形態及病毒感受性之比較…………………………………17 1. 形態上之比較 ……………………………………………………………18 2. 對供試病毒之感受性測試 ………………………………………………18 七、細胞株特性之建立…………………………………………………………18 1. 生長速率測定 ……………………………………………………………18 2. 染色體數目分析 …………………………………………………………19 3. 同功異構酶之分析 ………………………………………………………19 4. DNA 分子標示鑑定法 …………………………………………………20 八、EGFP 相對螢光值測量……………………………………………………22 ii 1. 感染細胞之蛋白質取樣 …………………………………………………22 2. 蛋白質定量 ………………………………………………………………23 3. 螢光值測量 ………………………………………………………………23 肆、結果………………………………………………………………………………24 一 、次選殖 （sub-clone） 細胞株的建立……………………………………24 二、次選殖細胞株形態及病毒感受性之比較…………………………………24 1. 形態上之比較 ……………………………………………………………24 2. 對各種供試病毒之感受性 ………………………………………………24 三、選殖細胞株之特性…………………………………………………………26 1. 細胞株生長速率之比較…………………………………………………26 2. 染色體數目分析…………………………………………………………26 3. 同功異構酶之分析………………………………………………………26 4. ITS 序列分析 ……………………………………………………………27 四、EGFP 相對螢光分析………………………………………………………27 伍、討論………………………………………………………………………………28 陸、參考文獻…………………………………………………………………………33 柒、圖表………………………………………………………………………………43 捌、附錄………………………………………………………………………………66 附錄一、同功異構酶電泳與染色……………………………………………………66 附錄二、實驗所使用之引子對及其序列……………………………………………70 iii 表次 表一 IPLB-LD652Y 細胞株系母株與次選殖株之不同細胞形態比例…………43 表二 IPLB-LD652Y 細胞株系各細胞形態大小 ……………………………… 44 表三 IPLB-LD652Y 細胞株系、SL-7B 細胞及 NTU-LY4S 在感染 Ly5 後第 7 天之感染細胞比率………………………………………………………. 45 表四 IPLB-LD652Y 細胞株系、SL-7B 細胞及 NTU-LY4S 在感染 Ly5 後第 14 天之感染細胞比率………………………………………………………46 表五IPLB-LD652Y 細胞株系、SL-7B 細胞及 NTU-LY4S 在感染 LyxyExp-DsRed 後第 3、7、10 及 14 天之發螢光細胞比率…………… 47 表六IPLB-LD652Y 細胞株系、SL-7B 細胞及 NTU-LY4S 在感染 LyxyExp-EGFP 後第 3、7、10 及 14 天之發螢光細胞比率…………48 表七 0％、4％、8％ 及 6％ 血清濃度下培養 IPLB-LD652Y、IPLB-LD652Y-5、 IPLB-LD652Y-7 及 IPLB-LD652Y-f 細胞株之細胞生長所需倍增時 間…………………………………………………………………………… 49 表八 ITS rDNA 序列相似度………………………………………………………50 iv 圖次 圖一 核醣體 DNA 之結構及各引子與 r DNA 之關係 ………………………51 圖二 IPLB-LD652Y 細胞株系細胞形態…………………………………………52 圖三 IPLB-LD652Y 細胞株感染Ly5 後第 7 天之感染形成之細胞病變…….54 圖四 IPLB-LD652Y 細胞株系細胞感染Ly5 後7 天之胞外病毒效價…………55 圖五 IPLB-LD652Y 細胞株系細胞感染Ly5 後7 天之核多角體產量 ………56 圖六 IPLB-LD652Y 細胞在感染Lyxy Exp-DsRed 後第 3、7、10 及 14 天之 發螢光細胞………………………………………………………………… 57 圖七 IPLB-LD652Y 細胞在感染Lyxy Exp-EGFP 後第 3、7、10 及 14 天之 發螢光細胞………………………………………………………………… 58 圖八 不同血清濃度下培養 IPLB-LD652Y（a）、IPLB-LD652Y-5（b）、 IPLB-LD652Y-7（c） 及 IPLB-LD652Y-f （d） 細胞株之細胞生長曲線…59 圖九 8 ％ 血清濃度條件下培養 IPLB-LD652Y 、IPLB-LD652Y-5 、 IPLB-LD652Y-7 及 IPLB-LD652Y-f 細胞株之細胞生長曲線及倍增時間 之比較 ………………………………………………………………………60 圖十 IPLB-LD652Y、IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7 及 IPLB-LD652Y-f 細 胞株之染色體數分布圖…………………………………………………… 61 圖十一 IPLB-LD652Y、IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7、IPLB-LD652Y-f 及 LY1 細胞株之同功異構酶電泳圖譜 ………………………………… 62 圖十二 IPLB-LD652Y、IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7 及IPLB-LD652Y-f 細胞株之 ITS 片段序列比較 ………………………………………… 64 圖十三 IPLB-LD652Y、IPLB-LD652Y-5、IPLB-LD652Y-7 及 IPLB-LD652Y-f 細胞株在感染 Lyxy Exp-EGFP 後第 48、96、144、192 及 240 小 時之EGFP 相對螢光值………………………………………………… 651186909 bytesapplication/pdfen-US舞毒蛾細胞株木毒蛾核多角體病毒次選殖IPLB-LD652Y cell lineLyxyMNPVsub-clonethesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/55070/1/ntu-95-P93632001-1.pdf