周正俊臺灣大學：食品科技研究所陳瑞琳Chen, Jui-LinJui-LinChen2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56397本研究乃試圖了解酸馴化處理對仙人掌桿菌在後續環境壓力 (有機酸、高溫、低溫、高鹽、乙醇及過氧化氫) 下存活之情形，並探討酸馴化影響仙人掌桿菌腸毒素 (enterotoxin) 產生之情形。 結果顯示，在pH 5.5經過不同時間酸馴化處理之B. cereus 1-4-1，暴露於後續酸性環境 (pH 4.0) 4小時後，以酸馴化2小時處理之菌體有最高之存活率。當菌株暴露於含40 mM之有機酸 (醋酸、丙酸、乳酸、檸檬酸及酒石酸) 磷酸緩衝溶液 (pH 4.0) 時，酸馴化菌體對有機酸之耐受性較未酸馴化菌體高。此外，酸馴化處理可顯著 (p<0.05) 提升菌體對高溫 (49℃) 之耐受性及冷凍 (-18℃) 之抵抗力，然而酸馴化處理卻增加菌體對冷藏溫度 (4℃)、高塩 (20%) 及乙醇 (20%) 之敏感性，酸馴化菌體與未酸馴化對過氧化氫 (5 mM) 之敏感性並無顯著性 (p>0.05) 差異。酸馴化菌體所測得之菌體懸浮上清液及菌體分解液之腸毒素含量均較未酸馴化菌體低，當菌體生長於TSB培養基中，直到培養4小時前，酸馴化菌體之生長及腸毒素產量較未酸馴化菌體高。This study was conducted to investigate the effect of acid adaptation on the survival of Bacillus cereus 1-4-1 under subsequent environmental stresses (organic acids, high and low temperatures, high salts, ethanol and hydrogen peroxide). Besides, the enterotoxin production and protein expression of B. cereus 1-4-1 as influenced by acid adaptation were also examined. It was found that Bacillus cereus 1-4-1 cells subjected to acid adaptation at pH 5.5 for 2 h exhibited the highest percentage of survival after exposure to phosphate buffer solution with pH 4.0 for 4 h. The acid-adapted cells showed a higher tolerance than the non-adapted cells when exposure to phosphate buffer solution (pH 4.0) containing 40mM organic acids (acetic acid, propionic acid, lactic acid, citric acid, tartaric acid). Furthermore, acid adaptation significantly (p<0.05) increased the thermal tolerance (49℃) and freezing (-18℃) resistance of Bacillus cereus 1-4-1. On the other hand, acid adaptation increased the susceptibility of Bacillus cereus 1-4-1 to refrigerative temperature (4℃), high salts (20%) and ethanol (20%). It was also showed no significant difference (p>0.05) susceptibility of the acid-adapted cells and non-adapted cells to hydrogen peroxide (5 mM). The cell-free supernatant and cell lysate of the acid-adapted cells showed less amount of enterotoxin than that of the non-adapted cells. Grown in TSB, the acid-adapted cells exhibited a higher level of growth and enterotoxin production than did the non-adapted cells until after 4 h of cultivation.中文摘要 I Abstract I 目錄 II 表目錄 IV 圖目錄 V 壹、前言 1 貳、文獻整理 2 一、仙人掌桿菌 (Bacillus cereus) 2 (一) 仙人掌桿菌之基本特性 2 (二) 仙人掌桿菌毒素 4 1. 腹瀉型腸毒素 (Diarrheal enterotoxin) 5 2. 嘔吐型毒素 (Emetic toxin, cereulide) 7 3. 溶血素 (Hemolysins) 8 4. 磷脂酶 (Phospholipase) 8 (三) 仙人掌桿菌之感染症狀 9 1. 腹瀉型症狀 (Diarrheal Syndrome) 9 2. 嘔吐型症狀 (Emetic Syndrome) 9 (四) 仙人掌桿菌與食品中毒及其分佈 10 二、酸馴化反應 11 (一) 酸馴化之機制 12 (二) 酸馴化對菌體之影響 16 1. 酸馴化對菌體細胞膜之影響 16 2. 酸馴化對菌體毒素之影響 18 (三) 酸馴化菌體在後續環境壓力及酸性食品存活之情形 19 1. 酸馴化菌體在後續環境壓力下存活之情形 19 2. 酸馴化菌體在酸性食品中存活之情形 21 參、材料與方法 23 一、實驗材料 23 (一) 菌種 23 (二) 培養基 23 (三) 試驗藥品 23 (四) 儀器設備 23 二、實驗方法 24 (一) 菌株之保存 24 (二) 實驗菌株接種源之製備 24 (三) 不同pH值對B. cereus生長存活之影響 24 (四) B. cereus之酸馴化處理 25 (五) 酸馴化處理時間對B. cereus耐酸性影響之試驗 25 (六) 酸馴化處理影響B. cereus於不同有機酸環境下之存活試驗 25 (七) 酸馴化處理影響B. cereus於高溫和低溫環境下之存活試驗 25 1. 高溫存活試驗 26 2. 低溫存活試驗 26 (八) 酸馴化處理影響B. cereus於高鹽、乙醇、過氧化氫環境之存活試驗 26 (九) 酸馴化處理對B. cereus腸毒素產生之影響 26 1. B. cereus菌體細胞內與細胞外腸毒素之測定 26 2. B. cereus菌體於後續培養液中生長及腸毒素之測定 27 (十) 蛋白質抑制劑之添加對酸馴化處理之B. cereus耐酸性之影響 27 (十一) 菌數之測定 27 (十二) 統計分析 28 肆、結果與討論 29 一、B. cereus在不同pH值之生長存活試驗 29 二、不同酸馴化處理時間對B. cereus耐酸性之影響 31 三、酸馴化處理對B. cereus於有機酸環境下存活之影響 33 四、酸馴化處理對B. cereus於高溫下存活之影響 38 五、酸馴化處理對B. cereus於低溫下存活之影響 40 (一) 酸馴化處理對B. cereus 於4℃下存活之影響 40 (二) 酸馴化處理對B. cereus 於-18℃下存活之影響 41 六、酸馴化處理對B. cereus 於20 %食鹽環境下存活之影響 44 七、酸馴化處理對B. cereus 於20 %乙醇環境下存活之影響 46 八、酸馴化處理對B. cereus 於5 mM過氧化氫環境下存活之影響 48 九、酸馴化處理對B. cereus腸毒素產生之影響 50 (一) 酸馴化處理對B. cereus菌體細胞內與細胞外腸毒素產生之影響 50 (二) 酸馴化處理對B. cereus於後續培養液中生長與腸毒素產生之影響 53 十、蛋白質抑制劑對酸馴化B. cereus於後續酸性環境存活之影響 55 伍、結論 58 陸、參考文獻 59 柒、附錄 72 Ⅰ.仙人掌桿菌腸毒素逆向被動乳膠凝集測定法 (CRET-RPLA kit) 72680860 bytesapplication/pdfen-US酸馴化處理仙人掌桿菌環境壓力腸毒素acid adaptationBacillus cereusenvironmental stressesenterotoxinthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56397/1/ntu-96-R94641016-1.pdf