李芝珊臺灣大學：環境衛生研究所江婉嘉Chiang, Wan-ChiaWan-ChiaChiang2007-11-282018-06-302007-11-282018-06-302004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/59773傳統的培養方法 (Cultural Method)一直是主要的微生物分析方法，但此法相當耗時，且部分菌種對培養條件相當挑剔，因此往往會造成定量結果上的誤差，有鑑於此，對於微生物的分析有必要建立一個正確且快速的非培養方法 (Non-culture method)，以提供更完整的資訊。由於醫院污水內含有大量致病性微生物，且可能在污水處理過程中因曝氣使大量微生物逸散於周圍空氣中，使處理人員及附近居民之健康受威脅，因此本研究選定醫院污水作為研究對象，以非培養方法來評估醫院污水處理廠水中微生物的濃度與活性，應可對此環境中的微生物有進一步的了解。 本研究第一部分在建立螢光染色法之最佳化條件，並以螢光顯微鏡 (Epifluorescence Microscopy)與流式細胞儀 (Flow Cytometry)來定量微生物。第二部分則將已建立之最佳化分析法應用於醫院污水處理廠水中的微生物，利用具有不同染色機制的染劑，即具細胞穿透性而可測定總微生物濃度之acridine orange (AO)、4’,6 – diamidino - 2 - phenylindole dihydrochloride (DAPI)與以細胞膜破損與否定義微生物活性的YO-PRO-1、Propidium iodide (PI)，以非培養方法 - 螢光顯微鏡與流式細胞儀來分析各處理單元水中微生物的濃度與活性。 在微生物分析方法的建立方面：不同菌種之DAPI最佳化染色條件為，染劑濃度15 µg/ml配合染色時間30分鐘。本研究發現，染劑- AO、DAPI、YO-PRO-1與PI若以EFM與FCM分析被染劑染上的樣本，可成左瑰野峏騛篕睎藿瓞迉誘仄L生物的濃度與活性的分析。而醫院污水處理廠各處理單元水中總微生物濃度約為1.1×107 ~ 2.4×108 cells/ml，且在終沉池，總微生物濃度降低約10倍左右。各處理單元除放流池以外，以非培養方法定量之濃度比培養方法高11 ~ 100倍左右。由FCM分析結果可知，各處理單元水中的細菌濃度高於真菌濃度28 ~ 449倍 (細菌濃度：1.09×107 ~ 1.68×108 cells/ml；真菌濃度：5.35×104 ~ 4.48×106 cells/ml)。在微生物活性方面，細菌與真菌在尚未進行廢水處理的污水池中活性較高 (YO-PRO-1：0.74，PI：0.86)，而放流池中真菌與細菌的活性均較低，以YOPRO-1及PI分析真菌的活性分別為0.38及0.39，而以YOPRO-1及PI分析細菌的活性分別為 0.18及0.23。在放流池中由於氯的作用使微生物的culturability及viability降低，顯示加氯消毒對微生物的控制具一定成效。Culture-based analysis remains the primary methods for environmental sample analysis. But, there are some limitations of this method. The results always time-consuming and it can only account for a small proportion of the total cell count .Thus, providing a rapid and accurate non-culture method is needed. This study aims to provide a non-culture method for detecting microorganisms and validating this technique to the hospital wastewater. The nucleic-acid dyes acridine orange (AO) and 4’,6 – diamidino - 2 - phenylindole dihydrochloride (DAPI) penetrate all bacterial membranes, while YO-PRO-1 and Propidium iodide (PI) only penetrate cells with damaged membranes. After optimization, those nucleic-acid dyes were applied to estimate both total counts and viable of microorganisms in the hospital wastewater by using the epifluorescence microscopy and the flow cytometry. The results indicated that AO, DAPI, YO-PRO-1 and PI were the suitable dyes for determining total concentration and viability of microorganisms in the hospital waste water. The fluorescent techniques in combination with FCM and EFM for assessment of total concentration and viability for microorganisms were demonstrated to successfully apply for environmental field samples. The total concentrations of microorganisms in the hospital wastewater were 1.1×107 ~ 2.4×108 cells/ml and the concentrations of bacteria were 28 ~ 449 – folds higher than those of fungi . Besides, total counts in the outgoing water from clarifier showed dramatic reduction of over one log. The standard culture method underestimated the microorganism concentration over 11 ~100 –folds when compared to non-culture method except the effluent tank. In addition, the viabilities of microorganisms were high before treatment by YO-PRO-1 (0.74) and PI (0.86). However, the low viabilities of both bacteria (YO- PRO-1：0.18、PI：0.23) and fungi (YO- PRO-1：0.38、PI：0.39) were observed after chlorination tank. Therefore, the chlorination is an effective way to induce a decrease in culturabilities and viabilities of microorganisms.總目錄 摘要 I Abstract III 總目錄 V 表目錄 VII 圖目錄 VIII 第一章 前 言 1 1.1 研究緣起 1 1.2 研究目的 2 第二章 文 獻 回 顧 3 2.1 微生物之分析 3 2.1.1 培養方法 3 2.1.2 非培養方法 3 2.1.3 螢光顯微鏡 4 2.1.4 流式細胞儀 4 2.1.5 螢光染色法 5 2.2 應用螢光染色法以螢光顯微鏡與流式細胞儀分析微生物之 研究 8 2.2.1 以螢光染色法利用螢光顯微鏡分析環境中的微生物 8 2.2.2 以螢光染色法利用流式細胞儀分析環境中的微生物 9 2.2.3 以螢光染色法利用螢光顯微鏡與流式細胞儀分析環 境中的微生物 .9 2.3醫院廢水 10 2.3.1 醫院廢水之特性 10 2.3.2 相關醫院廢水之研究 11 第三章 材 料 與 方 法 14 3.1 實驗儀器與材料 14 3.1.1 實驗儀器 14 3.1.2 實驗材料 15 3.1.3 實驗菌種 17 3.2 實驗方法與步驟 19 3.2.1 螢光顯微鏡 (EFM) 19 3.2.2 流式細胞儀 (FCM) 22 3.2.3 醫院污水處理廠水樣 28 第四章 結 果 與 討 論 33 4.1 醫院污水廠處理水的基本性質 33 4.2 醫院污水廠水中微生物的分析 33 4.2.1 總微生物濃度 34 4.2.2 微生物活性 37 4.2.3 廢水處理廠中大腸桿菌群 (Coliform group) 39 第五章 結 論 與 建 議 41 5.1 結論 41 5.2 建議 43 參考文獻 44 口試委員意見之回覆 77 表目錄 表一 利用傳統方法培養環境中微生物的可能性 49 表二 各種非培養分析方法之特性 50表三 使用兩種不同菌種，以FCM搭配各種染劑分析菌種 濃度濃縮10倍與100倍之結果 51 表四 利用FCM (AO)與Culture分析醫院污水處理廠水中微 生物濃度 52 圖目錄 圖一 FCM分析原理 52 圖二 研究架構 53 圖三 DAPI在不同染色時間下所得之各種純菌濃度(cells/ml) 54 圖四 不同DAPI濃度 (µg/ml)所測得之各種純菌濃度(cells/ml) 54 圖五 以AO進行具100 %活性的各種菌株的染色 55 圖六 以YO-PRO-1進行具有60 %活性的各種菌株的染色 56 圖七 以PI進行具有60 %活性的各種菌株的染色 57 圖八 醫院污水廠處理流程圖 58 圖九 利用AO以FCM分析醫院污水處理廠細菌濃度(cells/ml) 59 圖十 利用AO以FCM分析醫院污水處理廠真菌濃度(cells/ml) 60 圖十一 利用YO-PRO-1以FCM分析醫院污水處理廠細菌活性 61 圖十二 利用YO-PRO-1以FCM分析醫院污水處理廠真菌活性 62 圖十三 利用PI以FCM分析醫院污水處理廠細菌活性 63 圖十四 利用PI以FCM分析醫院污水廠真菌活性 64 圖十五 利用測總菌數濃度的染劑- AO (左圖)與DAPI (右圖)， 以EFM分析醫院污水處理廠水中的微生物 65 圖十六 利用染不具活性的微生物染劑- YO-PRO-1 (左圖)與 PI (右圖)，以EFM分析醫院污水處理廠水中的微生物 65 圖十七 利用DAPI以EFM觀察曝氣池內的活性污泥微生物 66 圖十八 利用AO以FCM分析調節池 (左圖)與曝氣池 (右圖) 66 圖十九 利用AO以FCM分析醫院污水廠終沉池的微生物濃度 (cells / ml) 67 圖二十 利用AO以EFM觀察終沉池內微生物 67 圖二十一 比較三種分析方法評估醫院污水廠各處理單元水中 微生物的濃度 (cells mL-1, CFU mL-1)，Error bars： 1SD 68 圖二十二 利用AO以FCM評估醫院污水廠各處理單元水中細菌之濃 度(cells/ml)，並與Culture所測得之細菌濃度(CFU/ml) 做比較，Error bars：1SD 69 圖二十三 利用AO以FCM評估醫院污水廠各處理單元水中真菌 之濃度 (cells/ml)，並與Culture所測得之真菌濃度 (CFU/ml)做比較，Error bars：1SD 69 圖二十四 利用測總菌數之染劑- AO與DAPI，以EFM評估醫院 污水廠各處理單元水中微生物之濃度(cells ml-1)， Error bars：1SD 70 圖二十五 利用YO-PRO-1與PI兩種染劑，以EFM分析醫院污 水廠各處理單元水中微生物之活性。並比較Non-culture (EFM)與 Culture分析醫院污水處理廠水中微生物之 活性，Error bars：1SD 71 圖二十六 使用YO-PRO-1，以FCM分析醫院污水廠各處理單 元水中細菌之活性，並比較Non-culture (FCM)與 Culture分析醫院污水處理廠水中細菌之活性， Error bars：1SD 72 圖二十七 使用YO-PRO-1，以FCM分析醫院污水廠各處理單 元水中真菌之活性。並比較Non-culture (FCM)與 Culture 分析醫院污水處理廠水中真菌之活性 72 圖二十八 使用PI，以FCM分析醫院污水廠各處理單元水中 細菌之活性 ，並比較Non-culture (FCM)與 Culture 兩種方法所得之細菌活性 73 圖二十九 使用PI，以FCM分析醫院污水廠各處理單元水中真 菌之活性，並比較Non-culture (FCM)與Culture兩種 分析方法所得之真菌活性 73 圖三十 利用YO-PRO-1以FCM分析醫院污水處理廠細菌之活性 74 圖三十一 利用YO-PRO-1以FCM分析醫院污水廠真菌之活性 74 圖三十二 利用PI以FCM分析醫院污水處理廠細菌之活性 75 圖三十三 利用PI以FCM分析醫院污水廠真菌之活性 75 圖三十四 利用標準方法-濾膜法，評估醫院污水廠各處理單元 水中大腸桿菌群，Error bars：1SD 76855702 bytesapplication/pdfen-US流式細胞儀螢光染劑螢光顯微鏡Epifluorescence MicroscopyFluorochromeFlow Cytometrythesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/59773/1/ntu-93-R91844004-1.pdf