陳昭瑩臺灣大學：植物病理與微生物學研究所劉益宏Liu, Yi-HungYi-HungLiu2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/58076植物在受到生物或非生物因子的刺激，會使植物之生理生化發生改變，造成植物開啟多重複雜的防禦機制，使植物具有對抗非生物逆境及病原菌侵染的能力，以適應環境的變遷。目前在植物體內的防禦機制可分為先天及誘導抗病性；誘導抗病性之區分為systemic acquired resistance (SAR)、induced systemic resistance (ISR)及過敏性反應(hypersensitive response, HR)等。百合灰黴病菌(Botrytis elliptica [Berk.] Cooke)危害百合葉片及花器，為百合重要病害。為開發適用於台灣百合(Lilium formosanum Wall., Formosa lily)的生物防治菌株，自台灣百合根圈採集土壤樣品，以土壤稀釋平板法分離及純化出62株細菌菌株，並經氣相層析儀分析脂肪酸的組成及含量以鑑定菌種。將不同菌株細菌懸浮液澆灌在台灣百合根圈，篩選對百合植株沒有負面影響，甚至略有促進生長作用之菌株，在台灣百合及葵百合(Lilium ‘Star Gazer’)上進行溫室防治試驗，並在台灣百合、葵百合及阿卡波克百合(Lilium ‘Acapulco’)上進行實地田間防治試驗，結果顯示皆能有效地降低灰黴病罹病嚴重度及減少病斑的數目，顯示可以應用根圈細菌保護百合之地上部組織，避免灰黴病的危害；進一步為獲得百合抗病性表現的相關基因或分子標記，以PCR-select cDNA subtraction方法獲得百合受根圈細菌誘導表現之mRNA互補股DNAs，其中有23個cDNA選殖株在根圈細菌處理後有差異性表現。Stimulations of biotic or abiotic factors alter physiological or biochemical reactions of plants to evolve multiple complex defense mechanisms for resistance to adverse stress and pathogen infection. So far, plant defense mechanisms include pre-existed and induced resistance. Induced resistance of plants includes systemic acquired resistance (SAR)、induced systemic resistance (ISR) and hypersensitive response (HR). Botrytis leaf and blossom blight caused by Botrytis elliptica (Berk.) Cooke is an important disease for the bulb and flower productions of Lilium spp. and causes severe losses of yield and value of lilies in Taiwan. For biocontrol of Lilium formosanum Wall., application of rhizobacteria was proposed for practical use. Sixty-two bacterial strains were isolated and purified from L. formosanum rhizosphere soil by dilution plate method and identified according to the fatty acid profiles by MIDI identification system. Bacterial strains promoting the growth of the seedling of Formosa lily, without negative effect, were selected. The greenhouse and field disease control assay showed that the disease severity of Botrytis leaf blight could be decreased effectively by application of bacterial suspension of Bacillus spp. and Pseudomonas spp. in the rhizosphere of lily plants. For cloning of defense-related genes or molecular markers for the induced resistance of L. formosanum, PCR-select cDNA subtraction was implemented to screen out the rhizobacterium-responsive genes. Among 193 clones, twenty-three were differentially expressed as indicated by dot blot hybridization.目 錄 壹、中文摘要………………………………………………………………..…………1 貳、英文摘要………………………………………………………………..…………2 參、前言……………………………………………………………………..…………3 肆、前人研究…………………………………………………………………………..6 一、百合灰黴病…………………………………………………………………..6 二、根圈細菌在植物病害防治之應用……………….…………………………7 三、根圈拮抗細菌之生物防治機制…………………….……………………….7 四、植物誘導抗病性…………………………………….……………………….8 五、螢光假單胞菌菌株之應用………………………………………………….9 六、桿菌屬細菌菌株之應用……………………………………………………10 七、根圈細菌誘導之植物抗病性分子機制…………………...………………11 伍、材料與方法………………………………………… …………………………..13 一、灰黴病病菌之培養……………………………… ……………………..13 二、台灣百合根圈細菌之分離及純化……………… ………………………..13 三、台灣百合根圈細菌之鑑定……………….………………………………..13 四、篩選對台灣百合幼苗生長無不良影響之根圈細菌………………...…….15 五、促進台灣百合抗灰黴病根圈細菌菌株之篩選試驗…………..……..15 六、生物防治試驗……………………………………………………..15 1. 溫室防治試驗………………………………………………………….15 2. 實地田間防治試驗……………………….……………………………16 七、台灣百合葉片全RNA之萃取……………………………………………..17 八、台灣百合葉片訊息RNA之萃取………………………………………18 九、構築PCR-select subtracted cDNA library………………………….………18 十、DNA黏接反應…………………………………………………..21 十一、大腸桿菌勝任細胞製備……………………..…………………………..21 十二、大腸桿菌細胞轉形反應………………………………………………..21 十三、菌落聚合酵素鏈鎖反應………………………………………………..22 十四、台灣百合cDNA探針之製…………………………………………….22 十五、雜合點漬分析篩選差異性表現之cDNA……………………………….23陸、結果……………………………………………………………………………..24 一、台灣百合根圈細菌之分離純化及脂肪酸鑑定…………………………..24 二、促進台灣百合生長之根圈細菌菌株……………………………….24 三、促使台灣百合幼苗抗灰黴病之根圈細菌菌株…………………….…….25 四、生物防治試驗……………………………………………………………..26 1. 溫室防治試驗………………………………………………………….26 2. 實地田間防治試驗……………………….……………………………27 五、根圈細菌誘導性基因之cDNA選殖…………………………….27 柒、討論…………………………………………………………………………….29 捌、參考文獻………………………………………………………………………..33 玖、圖表集………………………………………………………………………….40 表一、氣相層析儀脂肪酸分析鑑定布洛灣之台灣百合根圈細菌菌株………41 表二、施用根圈細菌對台灣百合幼苗感染灰黴病之影響（篩選試驗）……45 表三、施用根圈細菌對台灣百合幼苗感染灰黴病之抑制效果（溫室試驗）47 表四、施用根圈細菌對葵百合感染灰黴病抑制效果（溫室試驗）……………48 表五、施用根圈細菌對台灣百合感染灰黴病之抑制效果（田間試驗）……………….……………………………………………………….49 表六、施用根圈細菌對葵百合及阿卡波克百合感染灰黴病之抑制效果（田間試驗）…………………………………………………….……………….50 表七、PCR-select subtracted cDNA 之選殖株（193株）……………………..51 圖一、分離自布洛灣台灣百合根圈土壤之細菌種類…………………………53 圖二、施用根圈細菌對台灣百合幼苗葉數之影響…………………………..54 圖三、施用根圈細菌對台灣百合幼苗葉寬之影響…………………………..55 圖四、施用根圈細菌對台灣百合幼苗葉長之影響…………………………...56 圖五、台灣百合幼苗根圈土壤澆灌不同細菌懸浮液之結果…………………57 圖六、台灣百合幼苗根圈澆灌處理及葉片接種灰黴病菌之結果……………58 圖七、台灣百合葉片罹病度之分級……………………………………………59 圖八、施用根圈細菌對葵百合葉片感染灰黴病之影響………………………60 圖九、施用Bacillus cereus C1對阿卡波克百合感染灰黴病之影響…………61 圖十、PCR-select subtracted cDNA之電泳圖………………………………...62 圖十一、PCR-select subtracted cDNA選殖株之cDNA大小………………..63 圖十二、PCR-select subtracted cDNA選殖株之點漬雜合分析……………...64868657 bytesapplication/pdfen-US生物防治台灣百合百合灰黴病菌根圈細菌誘導系統性抗病biocontrolBotrytis ellipticaFormosa lilyRhizobacteriainduced systemic resistance (ISR)otherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/58076/1/ntu-93-R89633011-1.pdf