劉春櫻臺灣大學：化學研究所謝依玲Hsieh, Yi-LingYi-LingHsieh2007-11-262018-07-102007-11-262018-07-102004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/51655本研究以二氧化鈦溶膠凝膠塗佈熔融矽毛細管內璧，作為開管式毛細管電層析之靜相。首先使用titanium(IV) isopropoxide作為溶膠凝膠前驅物，在pH 1.5條件下將其快速水解縮合成二氧化鈦奈米粒子。實驗改變溫度(30 - 70℃)及攪拌時間，並以吸收度(λonset)來監測反應進行狀態，最佳條件為冰浴1小時後以50℃攪拌7小時。產物為穩定且透明的膠體溶液，由TEM推測粒徑約為10 nm。合成之膠體溶液再經由真空濃縮控制二氧化鈦濃度為40 %，利用氮氣裝置導入經由NaOH(1 M)活化之毛細管內，將管柱在150 ℃反應24小時，使溶膠之鈦醇基和毛細管表面的矽醇基進行縮合反應。所製備的二氧化鈦塗佈管柱經過電滲透流測試，發現以Tris及甲酸作為緩衝溶液時可測得管壁等電點為pH 5，pH低於此值則產生逆向的電滲流。而在glutamic acid與磷酸緩衝溶液中，因帶負電的動相分子會與管壁錯合形成一遮蔽層，在pH 2以上均為正向的電滲透流。換言之，不同的動相組成將導致不同的電滲流行為。因此本研究以三種血管收縮素Angiotensin I、Angiotensin II、[Sar1, Thr8]-Angiotensin II作為模型分子，探討二氧化鈦管柱之分離機制。實驗發現二氧化鈦塗佈次數的增加對分離並無影響，但表面因等電點(pH 5)較二氧化矽高(pH 2)，對分析物靜電吸附情形減少許多。由研究發現，其主要機制為與鈦金屬錯合，流析快慢為AgST > AgI > AgII。本研究並選擇不同的緩衝溶液包括Tris、甲酸、glutamic acid及磷酸，經由pH值(pH 2-10)以及緩衝溶液濃度(5-50 mM)等系列測試，發現動相會與分析物競爭管壁上的中心鈦原子而將分析物從靜相中交換出來，使層析峰的解析度大為提高且分離較為快速，錯合力大小依序為磷酸 > glu > Tris∼甲酸。實驗最佳化條件為40 mM、pH 6之磷酸緩衝溶液，平均理論板數3.1×104 m-1，RSD值為1.21-1.51% (N=5)。本研究進一步將此管柱應用於白蛋白serum albumin、ovalbumin及運鐵蛋白apo-transferrin、conalbumin之分析。藉由金屬錯合等作用力，可在接近生理條件下將結構與電泳度均相似的分析物解析開，流析順序為ConA > apoTf > OVA > BSA，並大致推得五種OVA醣蛋白的微異型結構。最佳條件為40 mM，pH 8之磷酸緩衝溶液，實驗RSD值為2.88-5.79% (N=3)。而在40 mM，pH 8之磷酸緩衝溶液條件下，可由雞蛋蛋白中同時分離出三種酸性及鹼性蛋白質，流析順序為lysozyme > ConA > OVA。並定量出OVA濃度約為0.26 g/mL。第一章 緒論...1 第一節 二氧化鈦...1 1-1 物理及化學性質...1 1-1.1 　基本結構...1 1-1.2 　表面酸性...2 1-2 溶膠凝膠法製備二氧化鈦...9 1-2.1 　前言...9 1-2.2 　反應機制...9 1-2.3 　反應參數...10 1-2.4 　粒徑控制...11 1-3 二氧化鈦應用...12 第二節 分析物簡介...15 2-1 胜肽分子...15 2-2 蛋白質...17 第三節 毛細管電層析簡介...21 3-1 毛細管電層析原理與文獻回顧...21 3-1.1 　前言...21 3-1.2 　毛細管電泳與電層析原理...22 3-1.3 　毛細管電層析種類介紹...24 3-2 開管式管柱表面塗佈及其於蛋白質分析之應用...27 3-2.1 　表面吸附...27 3-2.2 　共價鍵結...29 3-3 二氧化鈦粒子作為層析靜相之應用...31 第四節 研究動機...36 第二章 實驗部分...37 第一節 實驗儀器...37 第二節 實驗試藥...40 2-1 管柱製備...40 2-2 緩衝溶液...40 2-3 分析樣品...40 第三節 二氧化鈦奈米粒子合成與性質鑑定...41 3-1 二氧化鈦奈米粒子合成步驟...41 3-2 二氧化鈦奈米粒子性質鑑定...42 3-2.1 紫外光吸收光譜鑑定...42 3-2.2 穿透式電子顯微鏡鑑定...42 第四節 二氧化鈦管柱製備與性質鑑定...43 4-1 毛細管前處理...43 4-2 二氧化鈦管柱之製備...43 4-3 掃描式電子顯微鏡鑑定...43 第五節 毛細管電層析實驗操作...44 5-1 藥品配製...44 5-1.1 分析樣品...44 5-1.2 真實樣品前處理...44 5-2 毛細管電層析流程...45 5-3 二氧化鈦管柱之電滲透流測試...45 5-4 毛細管電層析應用於生物分子之分離...46 第三章 結果與討論...47 第一節 二氧化鈦膠體粒子之製備與鑑定...47 1-1 二氧化鈦膠體粒子之製備...47 1-2 二氧化鈦膠體粒子之性質鑑定...48 1-3 穿透式電子顯微鏡鑑定...52 第二節 二氧化鈦塗佈管柱之製備與鑑定...53 2-1 二氧化鈦塗佈管柱之製備...53 2-1.1 毛細管前處理...53 2-1.2 二氧化鈦溶膠凝膠塗佈管柱製備...53 2-2 管柱電滲透流測試及動相參數之探討...54 2-2.1 動相組成影響－甲酸及Tris緩衝溶液...55 2-2.2 動相組成影響－磷酸及glutamic acid緩衝溶液...57 2-2.3 動相濃度影響...60 2-3 掃描式電子顯微鏡鑑定...62 第三節 毛細管電層析之分析應用...64 3-1 胜肽分子之分離...64 3-1.1 塗佈次數影響...67 3-1.2 動相組成影響－甲酸及Tris緩衝溶液...69 3-1.3 動相組成影響－磷酸及glutamic acid緩衝溶液...76 3-1.4 動相濃度影響...84 3-2 蛋白質之分離...87 3-2.1 動相pH值影響...88 3-2.2 動相組成影響...90 3-2.3 動相濃度影響...92 3-3 真實樣品之分析...96 第四章 結論...99 參考文獻...1018471562 bytesapplication/pdfen-US溶膠凝膠蛋白質二氧化鈦胜肽毛細管電層析Titanium dioxidesol-gelcapillary electrochromathesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/51655/1/ntu-93-R91223040-1.pdf