陳林祈Chen, Lin-Chi臺灣大學:生物產業機電工程學研究所高群豐Kao, Chun-FengChun-FengKao2010-05-052018-07-102010-05-052018-07-102008U0001-2307200821513100http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/180199近年來，由於生物領域的蓬勃發展與醫療意識的抬頭，使生物性檢測裝置快速地發展開來。有鑑於自動化技術在生物樣本純化上擁有有相當大的成長空間，本研究嘗試以光機電整合技術，發展出一套快速自動化生物分子純化電泳系統，進而應用在自動化篩選、純化生物性樣本或是DNA定序等方向，並幫助研究人員以自動化技術進行各類核酸實驗，節省以往所需耗費的人力與時間。 於上述動機，本研究在系統開發上先以石英管柱膠體電泳進行生物性樣本的即時偵測。實驗結果證明此系統能成功將DNA ladder分離，但在後續的純化回收上有其困難之處。因此，本研究另行發展出一套多端點膠體電泳裝置，其元件以壓克力為基材，經由機械加工，將電泳通道佈於其上，並搭配光電二極體和綠光LED或UV光源，形成一套三明治結構的實驗模組。同時為了將自動化運用在電泳系統上，在後端部分接上放大電路、資料擷取卡、BJT電晶體和繼電器，加上LabVIEW程式的控制，整合為生物分子自動純化回收之電泳系統。 開始的系統測試上，先以帶有負電性的DNA追蹤染劑為實驗樣本。因為DNA追蹤染劑在設計時即對應到不同長度的DNA片段，故可以此模擬DNA的實驗，進行純化回收的步驟。從實驗結果可看出，三條帶有不同顏色的染劑被各自回收到相異的緩衝溶液槽中。經由計算後得到回收率介於56%到88% 之間，證實此系統確實能執行自動純化回收的動作。因此，我們繼續以DNA樣本及PCR產物進行即時性生物感測實驗，結果顯示系統一樣能偵測到樣本訊號，並進行純化回收的動作，回收率介於40%到60% 之間，且無汙染的問題發生。以上結果可以得知，本研究開發的多端點膠體電泳裝置確實能進行生物分子的純化及回收動作，未來若能將其模組化或發展成可攜式即時檢測儀器，必定能為從事生物領域的研究人員節省許多時間及寶貴人力，獲得更高的實驗效率。Biomolecule purification is an important step for biochemical experiments and there is an increasing need to develop automated purification system. For this reason, automated purification of biomolecules by multiterminal gel electrophoresis is investigated in this study. PMMA-based, multiterminal electrophoresis device with dimensions of 50 mm x 100 mm x 10 mm was fabricated by machining in this work. The device featured a central channel for electrophoresis separation and two crossing channels for changing electrophoresis direction. The two LED/photodiode sensors were integrated with the device for automatic sample recovery.For demonstration, a mixture of three negatively charged dyes was tested in experiments of separation and purification. It was demonstrated that the dyes could be transported to different terminals sequentially within 30 min. Also, it was found that the dye recovery rate, ranged between 56% and 84%, was dependent on the electrophoresis distance: The longer path the dye traveled, the less the recovery rate was obtained.In addition to the dye molecules, automated separation of DNA fragments were done by a slight modification of the above device format. Accordingly, it is expected that the automated platform based on electrophoresis purification of biomolecules can be applied to on-chip screening and recovery applications.目錄 文摘要………………………………………………………………… Ibstract…………………………………………………………………… II錄………………………………………………………………………III目錄…………………………………………………………………… VI目錄…………………………………………………………………… IX號說明………………………………………………………………X 緒論……………………………………………………………1前言………………………………………………………1生物分子電泳技術………………………………………2 1-2-1 電泳膠體與設備…………………………………2 1-2-2 泳動原理…………………………………………3 1-2-3 DNA電泳實驗…………………………………5 1-2-4 電泳實驗問題及分析……………………………7研究動機與目的…………………………………………8研究架構…………………………………………………9二章 文獻回顧……………………………………………………10 2-1 管柱膠體電泳系統…………………………………… 10 2-2 十字型膠體電泳裝置系統…………………………… 14 2-3 多端終點膠體電泳裝置系統……………………………18 2-4 十字形膠體電泳通道電場擴散問題……………………24第三章 實驗設備與研究方法 …………………………………… 28 3-1 實驗儀器......................................28 3-2 實驗藥品與器材…………………………………………29 3-3 實驗方法…………………………………………………30實驗溶液及樣本……………………………30DNA管柱膠體電泳偵測實驗步驟…………31多端點膠體電泳裝置實驗步驟……………33 3-4 自動化光學即時偵測系統 ……………………………38實驗光源……………………………………38光電元件……………………………………39電路設計……………………………………42資料擷取卡與LabVIEW® 程式設計…………46自動化生物分子純化回收設計……………48第四章 實驗結果與討論 ………………………………………51 4-1 DNA管柱膠體電泳偵測實驗………………………52 4-2 DNA追蹤染劑電泳純化實驗………………………58 4-2-1 第一代電泳裝置…………………………… 59 4-2-2 第二代電泳裝置…………………………… 62 4-2-3 第三代電泳裝置…………………………… 65 4-2-4 第三代電泳裝置系統穩定度測試………… 76 4-2-5 DNA追蹤染劑回收率實驗結果…………… 80 4-3 DNA電泳偵測實驗………………………………… 81 4-4 綜合討論……………………………………………… 100 4-4-1 電泳裝置進行DNA追蹤染劑實驗分析… 100 4-4-2 電泳裝置進行DNA實驗分析…………… 101五章 結論與建議 ……………………………………………… 102 5-1 結論……………………………………………… 102 5-2 建議……………………………………………… 104六章 參考文獻…………………………………………………… 105七章 附錄………………………………………………………… 108目錄 1-1、 電泳示意圖………………………………………………………………6 1-2、 論文研究架構……………………………………………………………92-1、 管住膠體即時偵測系統示意圖……………………………………… 112-2、 DNA偵測極限訊號圖……………………………………………… 132-3、 十字型電泳晶片流道圖……………………………………………… 152-4、 十字型電泳晶片實驗流程圖………………………………………… 162-5、 十字型電泳晶片系統架構圖………………………………………… 17 2-6、 雙十字形電泳晶片設計架構圖………………………………………… 19 2-7、 雙十字形電泳晶片系統整體架構圖…………………………………… 202-8、 多端點電泳晶片設計架構圖…………………………………………212-9、 多端點電泳晶片整體實驗架構圖……………………………………22 2-10、 Hitachi SV 1210 microchip electrophoresis system…………………23 2-11、 DNA樣本在電泳晶片上分離流程圖……………………………………25圖 2-12、 DNA樣本在電泳晶片上擴散情形的流程圖……………………………26圖 2-13、 電泳晶片架構與其實驗進行示意圖……………………………………27圖 3-1、 管柱膠體設備示意圖……………………………………………………323-2、 第一代電泳裝置通道設計圖……………………………………………343-3、 第一代電泳裝置實體圖…………………………………………………34 3-4、 第二代電泳裝置通道設計圖……………………………………………353-5、 第二代電泳裝置實體圖…………………………………………………35 3-6、 第三代電泳裝置通道設計圖……………………………………………363-7、 第三代電泳裝置實體圖………………………………………………… 36 3-8、 DNA管柱膠體電泳和多端點電泳裝置實驗流程圖…………………37 3-9 、 第一代電路設計架構…………………………………………………… 42 3-10、 第二代電路設計架構…………………………………………………… 43 3-11、 第三代電路設計架構…………………………………………………… 45 3-12、 十字形雙通道電泳裝置即時偵測介面………………………………… 47 3-13、 電泳通道光源偵測位置示意圖………………………………………… 49 3-14、 樣本流經偵測點所造成的訊號改變…………………………………… 49 3-15、 自動化光學即時偵測系統整體流程架構圖…………………………… 50 4-1 、 管柱膠體電泳系統示意圖……………………………………………… 53 4-2 、 DNA ladder實驗失敗數據圖……………………………………… 54 4-3 、 DNA ladder實驗成功數據圖……………………………………… 55 4-4、 電泳膠體染EtBr後經UV箱照膠的結果………………………… 57 4-5、 第一代電泳裝置偵測位置示意圖……………………………………… 60 4-6、 DNA追蹤染劑在第一代電泳裝置上的測試實………………………61 4-7、 DNA追蹤染劑在第二代電泳裝置上所造成的問題…………………63 4-8、 DNA追蹤染劑在第二代電泳晶片上的分離實驗……………………64 4-9、 第三代電泳裝置系統元件圖……………………………………………66 4-10、 第三代電泳裝置系統架構圖……………………………………………67 4-11、 DNA追蹤染劑在第三代電泳裝置中湧動的情形……………………68 4-12、 DNA追蹤染劑在第三代電泳裝置中擴散的情形……………………69 4-13、 DNA追蹤染劑在第三代電泳裝置中純化回收的示意………………71 4-14、 DNA追蹤染劑在第三代電泳裝置中實驗結束的實體圖……………72 4-15、 DNA追蹤染劑在第三代電泳裝置中實驗數據圖……………………74 4-16、 DNA追蹤染劑在第三代電泳裝置中實驗數據圖……………………75 4-17、 以相同濃度之bromophenol blue進行三次重複性實驗………………77 4-18、 不同濃度之bromophenol blue感測實驗………………………………78 4-19、 不同濃度之bromophenol blue相對電壓訊號比較圖…………………79 4-20、 稀釋後之DNA追蹤染劑在第三代電泳裝置中實驗數據圖…………82 4-21、 62 mer單股DNA在第三代電泳晶片中實驗數據圖…………………83 4-22、 25 bp - 2000 bp DNA ladder在第三代電泳裝置中實驗數據圖………84 4-23、 62 bp DNA在十字型電泳膠體中泳動過程……………………………86 4-24、 30 bp / 62 bp / 166 bp混合之DNA樣本在十字形電泳膠體中分離情形………………………………………………………………………………………87 4-25、 DNA ladder樣本在十字形電泳膠體中分離情形………………… 87 4-26、 第三代電路進行bromophenol blue的實驗數據圖……………………89 4-27、 第三代電路進行bromophenol blue的實驗數據圖……………………90 4-28、 第三代電路進行62 bp DNA樣本的實驗數據圖……………………91 4-29、 第三代電路進行62 bp DNA樣本的實驗數據圖……………………92 4-30、 62 bp DNA在十字型電泳膠體中分離情形……………………………93 4-31、 回收的62 bp DNA在平板電泳膠體中分離情形………………………95 4-32、 第三代電路進行不同片段大小混合的DNA樣本實驗數據圖…………97 4-33、 第三代電路進行DNA ladder的實驗數據圖…………………………98 4-34、 回收的30 bp / 62 bp / 166 bp DNA樣本在平板電泳膠體中分離情形………………………………………………………………………………………99目錄3-1、本研究所需之儀器設備………………………………………………… 283-2、本研究所需之藥品及器材……………………………………………… 29 3-3、各元件在自動化過程所對應到的狀態………………………………… 484-1、DNA追蹤染劑所對應的序列長度…………………………………… 58 4-2、單一顏色的DNA追蹤染劑進行三次重複性實驗……………………… 76 4-3、三種顏色混和的DNA追蹤染劑實驗後的回收率……………………… 80 4-4、bromophenol blue實驗後的回收率…………………………………… 80 4-5、62 bp DNA實驗後的回收率…………………………………………… 94 4-6、30 bp / 62 bp / 166 bp 混合之DNA樣本實驗後的回收率……………… 96號說明 莫爾電導 (molar conductivity) 離子數目 (number of ions) 電場強度 分子的帶電量 外加電壓 電極距離 粒子半徑 介質黏滯係數 粒子泳動速度_f 摩擦力_ep 泳動率 浦郎克 (Plank) 常數 = 6.626 × 10-34 (J‧s)，或是4.14 × 1015 (ev‧s) 光速 = 3 × 108 (m/s) 光波長 (m)g 能帶間隙量 _V 電壓增益 _i 輸入電壓 _O 輸出電壓 _i 輸入電流 光二極體反應時間application/pdf3982416 bytesapplication/pdfen-US十字形電泳通道生物分子回收多端點電泳裝置自動DNA分離純化膠體電泳automated separationbiomolecule recoverycross channelsgel electrophoresismultiterminal biochipthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/180199/1/ntu-97-R95631037-1.pdf