林讚標臺灣大學：植物科學研究所傅俞菁Fu, Yu-JingYu-JingFu2007-11-272018-07-062007-11-272018-07-062007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/57937當植物暴露在不同逆境時會有大量的基因被誘導出來，而這些基因產物具有不同的功能以不同方式幫助植物對抗逆境。我們從Shinozaki在2002年發表的微矩陣序列分析資料中得到At2g20880基因的表現量在乾旱逆境下比正常生長狀況高出24倍。At2g20880轉錄因子被歸類為DREB subfamily一員，功能大多跟植物對抗逆境有關。利用RT-PCR發現At2g20880在根、莖、葉、花都有表現，但是在花的表現量較低。利用northern blot及RT-PCR確定在兩週大的阿拉伯芥野生型植株中At2g20880基因的表現量只有在乾旱逆境才會增加，不會受到高溫逆境及ABA的誘導而大量表現。我們利用RNAi（RNA interfering）方式專一性地抑制At2g20880基因，並確定At2g20880基因表現量下降；另外，將At2g20880基因全長構築於pB2GW7載體持續大量表現At2g20880基因。比較在正常生長狀況下，兩週大野生型、At2g20880突變株以及At2g20880大量表現轉植株的外表型態並無太大差異。接著觀察兩週大野生型以及At2g20880大量表現轉植株的耐旱能力，發現在乾旱環境下，轉植株的生長狀況比野生型好，存活率也比較高，證明在阿拉伯芥大量表現At2g20880基因可提高植物對乾旱的忍受力。ABA處理後，At2g20880基因表現量沒有上升；讓野生型與At2g20880大量表現轉植株生長在有ABA的情況下， 兩者之種子萌發率及根部生長狀況沒有差異，表示At2g20880大量表現轉植株對ABA敏感性沒有改變。將At2g20880基因全長構築於GFP蛋白表現載體（pK7WGF2）中。利用CaMV 35S啟動子表現GFP及At2g20880蛋白質。以基因槍將載體打入洋蔥表皮細胞，發現At2g20880在細胞質中有表現。由本篇實驗結果得知At2g20880會參與乾旱訊息傳導路徑，屬於ABA-independent pathway，在阿拉伯芥大量表現此基因可以提高植物耐旱能力，因此推測At2g20880為乾旱反應的正向調控者。Plants often meet many biotic and abiotic stresses throughout their life cycle. Assortments of genes with diverse functions are influenced by dehydration stresses. Most of their gene products may function in stress responses and tolerance at the cellular level. The predominant mechanism for controlling plant gene expression is regulated at the transcriptional level and is mediated by transcription factors (TFs). According to the microarray data of (Kamiya et al., 2002), we selected a dehydration-induced gene At2g20880 to study more detail in this paper. At2g20880 contains one highly conserved AP2 domain and belongs to DREB subfamily. Using RT-PCR, we found At2g20880 gene was expressed in root, stem, leaf, but has lower expression levels in flowers. We found that this gene was highly inducible by dehydration but not by high temperature and abscisic acid. The At2g20880 RNAi transgenic plants and At2g20880-overexpressing plants exhibited the same phenotype as wild-type under normal growth conditions. At2g20880-overexpressing plants, however, survived better than wild-type under water deficient condition. The expression of At2g20880 gene was not influenced by ABA treatment; and there is no difference in seed germination rate and root growth between At2g20880-overexpressing transgenic plants and wild type in the presence of ABA, suggesting that the ABA sensitivity of At2g20880-overexpressing transgenic plants was not altered. Localization study using a fusion protein consisting of the full length of At2g20880 coding region and GFP fusion under the control of 35S promoter revealed that the GFP fluorescence was detected in the cytoplasm but not in the nucleus. In this study, we found At2g20880 is involved in dehydration-induced signaling transduction in an ABA-independent manner. Overexpressing At2g20880 gene enhanced dehydration tolerance in Arabidopsis. Our study provides evidence that At2g20880 is a positive regulator in dehydration stress response.目錄 中文摘要 1 ABSTRACT 2 縮寫對照表 4 第一章 序論 5 植物對抗逆境的反應 5 乾旱逆境的訊息傳導 5 在阿拉伯芥中AP2/ERF SUPERFAMILY轉錄因子介紹 6 在阿拉伯芥中AP2/ERF SUPERFAMILY轉錄因子的功能 7 實驗起源與策略 7 第二章 材料與方法 9 實驗材料： 9 實驗方法： 9 一、阿拉伯芥之種植與生長： 9 阿拉伯芥之種植與生長 9 二、基因表現分析： 10 阿拉伯芥total RNA之萃取 10 RT-PCR 11 北方點墨法 12 三、載體與基因建構(CONSTRUCTION)： 15 PCR（Polymerase Chain Reaction）擴大基因片段 15 TA cloning 16 大腸桿菌之轉型 16 質體之製備 16 限制酶切割反應 17 LR重組反應 17 四、阿拉伯芥之農桿菌轉殖： 18 農桿菌的轉型作用 18 花序浸染法 19 阿拉伯芥轉殖株之篩選 19 阿拉伯芥genomic DNA之萃取 20 轉殖株快速檢測法 21 五、 基因表現定位： 21 基因槍法 22 六、 啟動子活性分析： 24 啟動子序列準備 24 報導基因GUS活性染色 25 第三章 結果 27 一、以生物資訊方式調查阿拉伯芥AT2G20880基因背景 27 二、以北方點墨法及反轉錄-聚合酶連鎖反應方式分析AT2G20880基因在 乾旱、高溫及ABA處理後的表現量 27 三、阿拉伯芥AT2G20880基因植物器官表現的位置 28 四、阿拉伯芥AT2G20880基因表現分析 28 五、在阿拉伯芥中大量表現AT2G20880影響植株對ABA的敏感性探討 30 六、阿拉伯芥AT2G20880在細胞內表現的位置 31 第四章 討論 32 第五章 圖表 37 參考文獻 52 附錄 56 圖表目錄 圖一 乾旱與高鹽逆境訊息傳導路徑圖…………………………………………37 圖二 At2g20880基因親緣演化關係圖…………………………………………38 圖三 GENEVESTIGATOR分析At2g20880在不同器官表現量 …………………39 圖四 GENEVESTIGATOR分析At2g20880在不同生長階段表現量 ……………40 圖五 At2g20880之AP2/ERF domain特徵 ……………………………………41 圖六 以北方點墨法及反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)方式分析At2g20880 基因在乾旱、高溫及ABA處理後的表現量……………………………………42 圖七 阿拉伯芥At2g20880基因在植物組織表現的位置………………………43 圖八 At2g20880 promoter::GUS轉殖株篩選…………………………………43 圖九 以T-DNA insertion方式專一性抑制At2g20880基因表現……………44 圖十 以RNAi方式專一性抑制At2g20880基因表現 …………………………45 圖十一 以CaMV 35S promoter大量表現At2g20880基因……………………46 圖十二 野生型、at2g20880突變株與AT2G20880大量轉殖株的性狀………47 圖十三 在阿拉伯芥中大量表現AT2G20880影響植株對ABA的敏感性探討…49 圖十四 阿拉伯芥AT2G20880蛋白質在細胞內表現的位置……………………50 圖十五 推論At2g20880參與在乾旱訊息傳導路徑圖示………………………512443083 bytesapplication/pdfen-US轉錄因子transcription factorotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/57937/1/ntu-96-R94b42021-1.pdf