徐濟泰Hsu, Jih-Tay臺灣大學:動物科學技術學研究所陳宜鴻Chen, I-HungI-HungChen2010-05-112018-06-292010-05-112018-06-292008U0001-2701200813584700http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/182003本試驗針對R. albus 7所分泌細菌素之半純化條件、特性與未來用於商業飼糧之可能性進行探討。R. albus 7細菌使用不含瘤胃液之化學培養基進行培養，參考文獻添3μM 3-phenylpropanoic acid與0.2% Tween 80當為刺激R. albus 7生長之刺激原，在連續培養下，從12至32小時的培養時間每6小時收取R. albus 7細菌素一次，尋找最適生產時間點，透過快速蛋白質分析儀（FPLC）以ion-exchange進行R. albus 7細菌素的半純化。特性分析則使用細菌素對Enterobacter aerogenes (BCRC 10370)、Salmonella enterica (BCRC 10747)、Pseudomonas aeruginosa (BCRC 10944)、Bacillus subtilis (BCRC 10029)及Staphylococcus aureus (BCRC 10451)等五種指標菌之抑菌效果。細菌素分子量的分析使用10% 原態電泳膠片（native-PAGE）抑菌活性測定方法估計，最小抑菌濃度則使用微劑量液態稀釋測定法（microtitre broth dilution method）進行測定，以飼料工業打粒常用溫度65℃，進行細菌素耐熱性檢驗，而在蛋白酶耐受性部分則使用胃蛋白酶（pepsin）、胰綜合酶（pancreatin）及商業蛋白酶（prokinase）等三種蛋白酶作用與比較，最終檢測使用1% bovine serum albumin為保護劑之效果。驗結果顯示R. albus 7能夠使用不含瘤胃液之培養基生產細菌素，且以培養時間24小時的細菌素抑菌總活性最佳，R. albus 7之未純化細菌素在初始試驗部分，即能展現最低64.5 % 最高80.5 % 的抑菌效果，後經5 kDa濃縮膜濃縮100倍，並使用FPLC配合DEAE管柱進行層析分離，在食鹽（NaCl）濃度0.23 M下，可獲得回收率達23 % 之半純化細菌素。使用原態膠體電泳進行活性分析結果顯示，R. albus 7細菌素應為33 kDa左右的蛋白質。經耐受性試驗測試，R. albus 7細菌素不能耐受pepsin、pancreatin、protease的水解作用或65℃之加熱處理，且進行家禽體外模擬消化試驗也顯示細菌素抑菌活力明顯下降74.7%以上（P < 0.05）。但當添加1% BSA為保護劑的情況下，則可減少抑菌活力下降比率達13%（P < 0.05）。在最小抑菌濃度測試中，R. albus 7細菌素若需達成50%抑菌濃度則至少需0.75 mg/mL，90%抑菌濃度則最少為6.5 mg/mL。培養基中添加刺激原3-phenylpropanoic acid（PPA）與Tween 80，可以使R. albus 7生長提早2小時達到高峰，同時使細菌素提早2小時產出，兩者共同添加更可以提早4小時產出，產量更可達到未添加時的2.5倍，其中又以有Tween 80添加的兩種處理均能獲得較好的抑菌效果（p < 0.05）。合上述，R. albus 7細菌素具備對抗常見病原菌的能力，在考量其特性後，可添加保護劑以增其耐受力，應能擴展更廣泛的應用範圍，使R. albus 7細菌素成為一具有替代抗生素潛力之產品。Our research was set up to find more detailed characteristics of the bacteriocin from R. albus 7 and its potential as alternative of antibiotics. We also tried to establish reliable production and semi-purification procedures. In our results, R. albus 7 could be cultured in the medium without ruminal fluid to produce bacteriocin effectively against five pathogens (Enterobacter, Bacillus, Pseudomonas, Samonella, Staphylococcus). MIC50 and MIC90 of R. albus 7 bacteriocin were as low as 0.75 mg/mL and 6.5 mg/mL, respectively. The bacteriocin is highly released after 24 hr of incubation. Inclusion of 3μM 3-phenylpropanoic acid（PPA）and 0.2 % Tween 80 in culturing medium improved 2.5 times production of bacteriocin. Native-gel electrophoresis showed that bacteriocin of R. albus 7 had a molecular weight about 33 kDa. Semi-purification procedure resulted in 23% recovery rate of bacteriocin by using the DEAE column in FPLC system. The bacteriocin of R. albus 7 could be destroyed by pepsin, protease, and pancreatin. It also could be inactivated after heating at 65℃for 1 hr. Simulated in vitro avian digestion decreased the antagonistic activity by 74.7%. But, addition 1% BSA could retain 13% more antagonistic activity.n conclusion, the bacteriocin of R. albus 7 is a heat-labile small protein. PPA and Tween 80 are recommended to be included in its production culture medium. DEAE column was suitable for its semi-purification. The bacteriocin of R. albus 7 has the chance as an antibiotic alternative with protectant added.目錄 頁次謝 i錄 iii次 iv次 vi、 前言 1、 中文摘要 2、 英文摘要 4、 文獻檢討 6、 材料與方法 27、 結果與討論 55、 結論 83、 參考文獻 84、 附錄 92application/pdf957270 bytesapplication/pdfen-US細菌素瘤胃細菌抗生素替代bacteriocinruminal bacteriaantibiotic alternativethesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/182003/1/ntu-97-R94626006-1.pdf