王勝仕臺灣大學：化學工程學研究所王柏偉Wang, Bo-WeiBo-WeiWang2007-11-262018-06-282007-11-262018-06-282007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/52287　　目前已發現至少有二十種蛋白質有可能產生類澱粉沉積而造成類澱粉症。在發病的過程中，此類蛋白質會轉變為具有大量ß-sheet構形的纖維結構（fibril），進一步自我聚集成大量的糾結體（aggregate）。雖然已知這類糾結體會在細胞或組織附近沉積並導致細胞死亡，但是類澱粉蛋白誘發疾病的真正原因和機制尚未清楚。 　　本研究以具有四對雙硫鍵的母雞蛋白溶菌酶為蛋白質模式系統，在含鹽類之酸性溶液環境下誘導生成類澱粉纖維，再配合二硫代蘇糖醇（DTT）破壞溶菌酶中的雙硫鍵，探討：（1）不同溫度下加入不同DTT濃度對溶菌酶類澱粉纖維形成之影響，（2）不同生長時期加入DTT對溶菌酶類澱粉纖維形成之影響，（3）不同比例之DTT和氧化態DTT濃度對溶菌酶類澱粉纖維形成之影響。我們研究結果發現，溫度會加速類澱粉纖維的生成，但不會增加生成的總量；而DTT不管在任何溫度下，破壞雙硫鍵後皆有抑制類澱粉纖維生長的效果，但如果在延遲期（lag phase）過後才加入DTT則沒有抑制效果。此外，加入氧化態DTT並不會對溶菌酶類澱粉纖維結構的生長或抑制產生任何效果。本研究不但針對溶菌酶類澱粉纖維形成機制進行探討，對於其形成過程中蛋白質結構變化也有深入的討論，相信本研究之成果應有助於近一步瞭解類澱粉症之分子機制。At least twenty different human proteins can fold abnormally to form fibrillar protein deposits which lead to so-called amyloid disease or amyloidoses. During the progression of these disease, these amyloidogenic proteins can self-assemble into stable fibrils with extensive ß-sheet conformation. While it is widely recognized that the dysfunction and concomitant death of cells is caused by the nearby protein aggregates, the underlying mechanism of amyloid diseases remains far from clear. The research presented here is aimed at exploring the effect of DTT on the in vitro fibril formation of hen egg-white lysozymes with four disulfide bonds. In this work, we specifically addressed (a) the effect of DTT concentration under different incubation temperatures on the hen lysozyme structure and fibril formation, (b) the effect of addition of DTT at later time points on the amyloid fibrillization of hen lysozymes, and (c) the effect of concentration ratio between reduced and oxidized forms of DTT on the fibril formation of lysozymes. We first demonstrated that the rate of fibril formation of hen lysozyme increased with incubation temperature; however, the content of amyloid fibrils was not the function of incubation temperature. Next, we showed that the inhibition of lysozyme amyloid formation by DTT owing to the breakage of disulfide bonds. Also, no inhibitory effect was observed if DTT was added at 12 hours after the launch of aggregation on hen lysozyme fibrillogenesis. Finally, we found that the oxidized form of DTT did not exhibit any inhibitory potency against amyloid fibril formation. The current research not only investigates the mechanism of amyloid protein self-assembly, but also examines the structures of lysozyme species during the course of aggregation process. We believe the outcome from this work will certainly further our understanding of the molecular mechanism(s) of amyloid diseases.目錄 摘要……………………………………………………………………………… Ⅰ Abstract…………………………………………………………………………… Ⅱ 目錄……………………………………………………………………………… Ⅲ 圖目錄…………………………………………………………………………… Ⅶ 表目錄…………………………………………………………………………… ⅩⅣ 第一章 緒論 …………………………………………………………………… 1 第二章 文獻回顧 ……………………………………………………………… 2 2-1蛋白質介紹 ………………………………………………………………… 2 2-1-1蛋白質的摺疊與聚集 …………………………………………… 5 2-1-2蛋白質的構型 …………………………………………………… 6 2-1-3 蛋白質摺疊模型 ………………………………………………… 6 2-1-4 能量鳥瞰圖和漏斗狀能量模型圖 ……………………………… 11 2-2 類澱粉症…………………………………………………………………… 14 2-2-1人類溶菌酶引起之疾病 ………………………………………… 16 2-2-2溶菌酶 …………………………………………………………… 17 2-3 二硫代蘇糖醇……………………………………………………………… 22 2-3-1 DTT的儲存 ……………………………………………………… 24 2-4 氧化壓力…………………………………………………………………… 25 2-5試管內（in vitro）蛋白質的聚集反應……………………………………… 27 2-5-1聚集體的型態與構造 …………………………………………… 29 2-5-2蛋白質中的雙硫鍵 ……………………………………………… 32 2-6蛋白質結構偵測方法簡介………………………………………………… 35 2-6-1 Congo red 鍵結測試……………………………………………… 35 2-6-2 Thioflavin T（ThT）螢光光譜測試……………………………… 35 2-6-3 ANS螢光光譜測試 ……………………………………………… 36 2-6-4 Intrinsic螢光光譜………………………………………………… 38 2-6-5 圓二色光譜測試 ………………………………………………… 39 2-6-6 Ellman reagent 測試雙硫鍵還原量……………………………… 41 2-6-7 穿透式電子顯微鏡……………………………………………… 43 第三章 研究動機……………………………………………………………… 44 第四章 實驗儀器、藥品、及步驟……………………………………………… 45 4-1 實驗儀器…………………………………………………………………… 45 4-2 實驗藥品…………………………………………………………………… 46 4-3實驗步驟 …………………………………………………………………… 47 4-3-1不同溫度下加入不同濃度DTT對母雞蛋白溶菌酶類澱粉纖維的形成和抑制劑的效果………………………………………………… 47 4-3-2不同時間下加入抑制劑DTT對類澱粉纖維形成的影響 ……… 47 4-3-3氧化還原對(DTT/DTTOX)對類澱粉纖維形成的影響…………… 48 4-3-4 ThT螢光光譜分析 ……………………………………………… 49 4-3-5 Congo red 鍵結分析……………………………………………… 49 4-3-6 遠紫外光二極光光譜分析……………………………………… 49 4-3-7 ANS螢光光譜分析……………………………………………… 50 4-3-8 聚集體濁度分析………………………………………………… 50 4-3-9 穿透式電子顯微鏡……………………………………………… 50 4-3-10 Ellman reagent測試分析 ……………………………………… 51 4-3-11 Intrinsic fluorescence 測量……………………………………… 53 第五章 結果與討論 …………………………………………………………… 54 5-1 利用鹽酸溶液並添加鹽類誘導雞蛋白溶菌酶類澱粉纖維之形成……… 54 5-2 不同溫度下加入不同濃度DTT對類澱粉纖維形成之影響……………… 56 5-2-1 在55℃下加入不同濃度之DTT………………………………… 56 5-2-2 於45℃下加入不同DTT濃度 ………………………………… 65 5-2-3 於37℃下加入不同DTT濃度…………………………………… 73 5-3 不同時間加入DTT對溶菌酶聚集行為的影響…………………………… 79 5-3-1 於55℃下在不同時間加入相同濃度DTT……………………… 79 5-3-2 45℃下不同時間加入相同濃度DTT ………………………… 86 5-4 DTT對雙硫鍵的破壞量 …………………………………………………… 89 5-4-1 不同濃度DTT對雙硫鍵破壞量………………………………… 89 5-4-2 不同時間加入相同DTT濃度對雙硫鍵破壞量………………… 91 5-5 不同比例之DTT/DTTOX對溶菌酶聚集行為的影響 …………………… 92 5-6 穿透式電子顯微鏡觀察…………………………………………………… 101 第六章　結果與建議…………………………………………………………… 103 6-1實驗結果 …………………………………………………………………… 103 6-2 建議與展望………………………………………………………………… 105 參考文獻………………………………………………………………………… 107 附錄一 以ANS作雙硫鍵對溶菌酶三級結構之動力學經驗式……………… 117 附錄二 溶菌酶之活性變化 …………………………………………………… 120 附錄三 溶菌酶類澱粉纖維成長動力學 ……………………………………… 122 附錄四 將2mg/ml濃度之溶菌酶中四根雙硫鍵全部還原所需DTT濃度之理 論值計算 ………………………………………………………………124 附錄五 DTT在含鹽類之酸性溶液下其自我氧化速率 ………………………125 圖目錄 圗 2-1-1 蛋白質摺疊模型---diffusion/collision、nucleation、collapse………… 8 圗 2-1-2 蛋白質的摺疊模型…………………………………………………… 8 圗 2-1-3 胜肽鏈形成蛋白質各種結構圖示…………………………………… 10 圗 2-1-4 Energy landscape 可以用來表示構種構形下蛋白質的能量 ……… 12 圗 2-1-5 蛋白質構形的funnel model ………………………………………… 13 圖 2-2-1 溶菌酶的二級結構…………………………………………………… 21 圗 2-2-2 雞蛋白溶菌酶3D立體結構圖……………………………………… 21 圖2-3-1 DTT還原態結構……………………………………………………… 22 圖2-3-2 DTT氧化態結構……………………………………………………… 22 圖2-5-1 纖維化聚集體的成長………………………………………………… 28 圖2-5-2 為四條protofibril 彼此以扭轉（twist）的方式纏繞在一起………… 30 圖2-5-3 以穿透式電子顯微鏡觀察母雞溶菌酶形成的類澱粉纖維………… 30 圖2-5-4 蛋白質形成雙硫鍵的機制…………………………………………… 34 圖2-6-1 剛果紅之化學結構圖………………………………………………… 37 圖 2-6-2 Thioflavin T之分子結構圖…………………………………………… 37 圖2-6-3 ANS 之分子結構圖…………………………………………………… 37 圖2-6-4 遠紫外光範圍CD圖譜 ……………………………………………… 40 圖2-6-5 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoic acid 結構式…………………………… 42 圖2-6-6 DTNB與cysteine反應式……………………………………………… 42 圖 5-1-1 溶菌酶在含鹽類之酸性高溫環境下，螢光放射強度隨時間之變化圖形 ………………………………………………………………… 55 圖 5-2-1溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，隨天數測量之ThT螢光光譜圖 …………………………………………………………………… 57 圖5-2-2 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，不添加DTT隨天數測量之congo red鍵結光譜圖……………………………………………… 57 圖 5-2-3 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下添加4mM DTT，隨天數測量之congo red鍵結光譜圖…………………………………………… 58 圖 5-2-4 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下添加2mM DTT，隨天數測量之congo red鍵結光譜圖…………………………………………… 58 圖 5-2-5 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下添加1mM DTT，隨天數測量之congo red鍵結光譜圖…………………………………………… 59 圖5-2-6 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，隨天數測量之Intrinsic螢光圖譜…………………………………………………………………… 60 圖5-2-7 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，不加入DTT隨天數測量之 遠紫外光圓二色極光光譜…………………………………………… 61 圖5-2-8 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，加入4mM DTT隨天數測量 之遠紫外光圓二色極光光譜………………………………………… 61 圖5-2-9 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，加入2mM DTT隨天數測量 之遠紫外光圓二色極光光譜………………………………………… 62 圖5-2-10 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，加入1mM DTT隨天數測 量之遠紫外光圓二色極光光譜…………………………………… 62 圖5-2-11 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，隨天數測量之ANS螢光圖譜…………………………………………………………………… 64 圖 5-2-12 溶菌酶在含鹽類之酸性55℃環境下，隨天數測量濁度(波長405nm下)之吸光………………………………………………… 64 圖 5-2-13 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下，隨天數測量之ThT螢光放射強度隨時間之變化……………………………………………… 65 圖5-2-14 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下不添加DTT，隨天數測量之 Congo red鍵結光譜圖……………………………………………… 66 圖5-2-15 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下添加4mM DTT，隨天數測量之congo red鍵結光譜圖………………………………………… 67 圖5-2-16 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下添加2mM DTT，隨天數測量 之congo red鍵結光譜圖…………………………………………… 67 圖5-2-17 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下添加1mM DTT，隨天數測量 之congo red鍵結光譜圖…………………………………………… 68 圖 5-2-18 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下，隨天數測量之Intrinsic螢光圖譜……………………………………………………………… 69 圖5-2-19 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下，不加DTT隨著天數觀察遠 紫外光圓二色極光光譜變化 ……………………………………… 70 圖5-2-20 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下，加入4mM DTT隨著天數觀察遠紫外光圓二色極光光譜變化………………………………… 70 圖5-2-21溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下，加入2mM DTT隨著天數觀察遠紫外光圓二色極光光譜變化………………………………… 71 圖5-2-22 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下，加入1mM DTT隨著天數觀察遠紫外光圓二色極光光譜變化……………………………… 71 圖5-2-23 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下，隨天數測量之ANS螢光圖譜 …………………………………………………………………… 72 圖5-2-24 溶菌酶在含鹽類之酸性45℃環境下，在405nm隨天數以96孔盤 測量濁度變化 ……………………………………………………… 73 圖5-2-25 溶菌酶在含鹽類之酸性環境37℃下，隨天數測量之ThT螢光放 射強度隨時間之變化 ……………………………………………… 74 圖5-2-26 溶菌酶在含鹽類之酸性環境37℃下，隨天數測量之Intrinsic螢光圖譜 ………………………………………………………………… 74 圖5-2-27 溶菌酶在含鹽類之酸性37℃環境下不添加DTT，隨天數測量之 Congo red鍵結光譜圖……………………………………………… 75 圖5-2-28 溶菌酶在含鹽類之酸性37℃環境下添加4mM DTT，隨天數測量 之Congo red鍵結光譜圖…………………………………………… 76 圖5-2-29 溶菌酶在含鹽類之酸性37℃環境下添加2mM DTT，隨著天數測量之Congo red鍵結光譜圖………………………………………… 76 圖5-2-30 溶菌酶在含鹽類之酸性37℃環境下添加1mM DTT，隨天數測量 之Congo red鍵結光譜圖…………………………………………… 77 圖5-2-31 溶菌酶在含鹽類之酸性環境37℃下，隨天數測量之ANS螢光圖 譜 …………………………………………………………………… 78 圖 5-2-32 溶菌酶在含鹽類之酸性37℃環境下，在405nm隨天數以96孔 盤測量濁度變化…………………………………………………… 78 圖5-3-1 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，分別在第零、二、五、八和第十五天加入2mM DTT，隨著天數觀察ThT螢光放射強度隨時間之變化 …………………………………………………………… 80 圖5-3-2 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，於第二天加入2mM DTT， 隨著天數變化觀察其Congo red鍵結圖譜 ………………………… 81 圖5-3-3 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，於第五天加入2mM DTT， 隨著天數變化觀察其Congo red鍵結圖譜 ………………………… 81 圖5-3-4 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，於第八天加入2mM DTT， 隨著天數變化觀察其Congo red鍵結圖譜 ………………………… 82 圖5-3-5 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，於第十五天加入2mM DTT， 隨著天數變化觀察其Congo red鍵結圖譜 ………………………… 82 圖5-3-6 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，分別在第零、二、五、八和 第十五加入2mM DTT，隨著天數觀察Intrinsic螢光圖譜………… 83 圖5-3-7 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，於第二天加入2mM DTT， 隨著天數變化觀察其far-UC CD spectra …………………………… 84 圖5-3-8 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，於第五天加入2mM DTT， 隨著天數變化觀察其far-UC CD spectra…………………………… 84 圖5-3-9 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，於第八天加入2mM DTT， 隨著天數變化觀察其far-UC CD spectra …………………………… 85 圖5-3-10 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，於第十五天加入2mM DTT，隨著天數變化觀察其far-UC CD spectra………………… 85 圖5-3-11 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性環境下，分別在第零、二、五、八和第十五加入2mM DTT，隨著天數觀察ANS螢光圖譜………… 86 圖5-3-12 溶菌酶在45℃含鹽類之酸性環境下，分別在第零、二、五、八 天加入2mM DTT，隨著天數觀察ThT螢光放射強度隨時間之變 化 …………………………………………………………………… 87 圖5-3-13 溶菌酶在45℃含鹽類之酸性環境下，分別在第零、二、五、八天加入2mM DTT，隨著天數觀察Intrinsic螢光圖譜…………… 88 圖5-3-14 溶菌酶在45℃含鹽類之酸性環境下，分別在第零、二、五、八天加入2mM DTT，隨著天數觀察ANS螢光圖譜………………… 88 圖 5-4-1 DTNB對cysteine作濃度校正曲線 ………………………………… 90 圖5-5-1 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，第零天加入不同比例之DTT/DTTOX之ThT螢光放射強度隨時間變化 …………………… 93 圖5-5-2 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，第零天加入不同比例之DTT/DTTOX之Intrinsic螢光圖譜…………………………………… 95 圖5-5-3 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，不加DTT隨天數觀察之 Far-UV CD spectra…………………………………………………… 96 圖5-5-4 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，加入2mM DTT隨天數觀 察之Far-UV CD spectra……………………………………………… 96 圖5-5-5 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，加入2mM DTTOX隨天數觀 察之Far-UV CD spectra……………………………………………… 97 圖5-5-6 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，加入2mM DTT和2mM DTTOX隨天數觀察之Far-UV CD spectra…………………………… 97 圖5-5-7 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，加入2mM DTT和4mM DTTOX隨天數觀察之Far-UV CD spectra…………………………… 98 圖5-5-8 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，加入4mM DTT和2mM DTTOX隨天數觀察之Far-UV CD spectra ………………………… 98 圖5-5-9 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，加入4mM DTT和隨天數觀 察之Far-UV CD spectra……………………………………………… 99 圖5-5-10 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，第零天加入不同比例之DTT/DTTOX之ANS螢光圖譜…………………………………… 100 圖5-6-1 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，不加入DTT之TEM顯示 圖…………………………………………………………………… 102 圖5-6-1 溶菌酶在含鹽類之酸性環境55℃下，加入4mM DTT之TEM顯 示圖…………………………………………………………………… 102 圖附錄1-1 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性溶液下，第五天測量其ANS螢光圖譜………………………………………………………………… 118 圖附錄1-2 由表附錄1-1套入動力學經驗式取log全對數圖形 …………… 119 圖附錄2-1 溶菌酶在55℃下含鹽類之酸性溶液中，各DTT條件下所的的活性回收率………………………………………………………… 121 圖附錄5-1 55℃下含鹽類之酸性溶液中加入1mM DTT，在280nm下測量 DTTOX之吸收值……………………………………………………125 表目錄 表2-1-1 二十種胺基酸之特性………………………………………………… 4 表 2-2-1 類澱粉症（蛋白質構形病）致病蛋白質一覽表…………………… 15 表2-2-2 誘發各種溶菌酶產生類澱粉纖維的條件…………………………… 18 表2-2-3 可改變lysozyme構型、活性或狀態的抑制劑或方法………………… 19 表2-2-4 雞蛋白溶菌酶之基本資料…………………………………………… 20 表 2-3-1 DTT之常見用途……………………………………………………… 23 表 2-3-2 DTT在不同pH值和溫度下的半生期……………………………… 24 表2-5-1可產生類澱粉纖維結構之類蛋白質及其結構模型………………… 31 表2-5-2 溶菌酶中雙硫鍵對其功用或影響…………………………………… 34 表2-6-1 遠紫外光範圍………………………………………………………… 40 表4-1-1 實驗儀器設備………………………………………………………… 45 表4-2-1 實驗藥品、生產公司與藥品等級…………………………………… 46 表 4-3-1 不同比例之DTT/DTTOX溶液……………………………………… 48 表5-2-1 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性溶液下各條件紅移的最大讀值 …… 60 表5-4-1 溶菌酶裡雙硫鍵還原程度…………………………………………… 90 表5-4-2 溶菌酶裡雙硫鍵還原程度…………………………………………… 91 表5-5-1 含鹽類之酸性溶液中裡不同DTT和DTTOX濃度比例 …………… 92 表6-1 實驗結果總整理………………………………………………………… 104 表6-2-1 雙硫鍵測定方法……………………………………………………… 106 表附錄1-1 溶菌酶在55℃含鹽類之酸性溶液下，在第五天以DTNB測量 各不同DTT濃度下對溶菌酶雙硫鍵的還原量 ………………… 119 表附錄2-1 溶菌酶在55℃下含鹽類之酸性溶液中DTT濃度條件………… 121 表附錄3-1 LHS在含鹽類之酸性溶液中各種條件下之動力學數值分析之計算值………………………………………………………………… 1231276798 bytesapplication/pdfen-US溶菌酶二硫代蘇糖醇類澱粉纖維雙硫鍵聚集體lysozymeDTTamyloid fibrildisulfide bondsaggregate[SDGs]SDG3thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/52287/1/ntu-96-R94524073-1.pdf