陳昭瑩臺灣大學：植物病理與微生物學研究所楊耿豪Yang, Ken-HaowKen-HaowYang2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/58066臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) C1L菌株篩選自台灣百合根圈，對百合灰黴病有防治的效果；本研究進行溫室和田間玉米葉枯病之防治試驗，以B. cereus C1L菌液澆灌玉米根圈，可有效地降低葉枯病發生的嚴重度，並有促進植株生長的作用，可以提高玉米葉片葉綠素含量、葉長、葉寬及植株鮮重、乾重。以B. cereus C1L細菌懸浮液處理玉米可減少葉枯病菌感染時所造成的過氧化氫暴升。利用反轉錄聚合酵素連鎖反應分析玉米葉片基因之表現，超氧化物歧化酵素基因(SOD4)與抗壞血酸過氧化酵素基因(cAPX)在處理B. cereus C1L 24小時之玉米葉片會有少許之增量表現；接種葉枯病菌時，SOD4及cAPX之表現量稍低於單獨接種葉枯病菌之基因表現量，推測B. cereus C1L可增加玉米植株對葉枯病菌感染的耐受性，強化了植株的基礎抗性，其原理與植物生理的調節有關。另一方面，為瞭解B. cereus C1L菌株強化植物基礎抗性的參與因子，自跳躍子Tn917ac1誘變之B. cereus C1L突變株中，篩選得到失去誘導系統性抗病能力之突變株C1LM-163與C1LM-179，其Tn917ac1均插入一新發現之質體pC1L8上。Biocontrol strain C1L of Bacillus cereus screened from the rhizosphere of Lilium formosanum could prevent the severe incidence of lily leaf blight. In this study, the green house and field biocontrol trials were performed by application of strain C1L to the rhizosphere of cron plants. The result showed that B. cereus C1L could reduce severe incidence of cron leaf blight; In addition, strain C1L could promote plant growth as shown by the increase of chlorophyll content, leaf width and length, and plant fresh and dry weight. Treatment of bacterial suspension of B. cereus C1L could reduce the level of hydrogen peroxide in the corn leaves. The reverse transcription-polymerase chain reaction analysis indicated that expression of superoxide dismutase gene (SOD4) and cytosolic ascorbate peroxidase gene (cAPX) increased slightly in the leaves of B. cereus C1L-treated cron plants as compared to that of the control. The expression of SOD4 and cAPX increased significantly after Cochliobolus heterostrophus attack; however, that exhibited lesser extent in the leaves from B. cereus C1L-treated cron plants. Thus, that B. cereus C1L increase the tolerance of cron plants to C. heterostrophus infection by strengthening the basal resistance is proposed, which may be related to the regulation of plant physiology. On the other hand, screening of Tn917ac1-directed mutants of B. cereus C1L for the reduction of ISR in maize againt C. heterostrophus achieved two ISR mutants, C1LM-163 and C1LM-179, in that of Tn917ac1 was located in a plasmid pC1L8 of B. cereus C1L.壹、中文摘要 5 貳、英文摘要 6 參、前言 7 肆、前人研究 9 一、玉米與玉米葉枯病 9 二、桿菌屬細菌(Bacillus spp.)菌株促進植物生長及植物保護之應用 10 三、有益根圈細菌促進植物生長之作用 11 四、拮抗細菌之作用機制 11 五、植物誘導抗病性 12 六、拮抗細菌誘導之植物抗病性分子機制 13 伍、材料與方法 15 (一) 生物防治試驗 15 一、溫室試驗植株之栽培 15 二、供試菌之培養與保存 15 三、罹病嚴重度計量及統計方式 15 四、處理B. cereus C1L菌株之ISR試驗 16 五、溫室防治試驗 16 六、田間防治試驗 17 (二) 田間玉米之生長試驗 17 (三) 玉米葉片葉綠素之抽取 18 (四) H2O2之萃取與定量 18 (五) C1L菌株引起玉米防禦相關基因表現探討 18 一、玉米葉片全RNA之萃取 19 二、玉米單股cDNA之合成 19 三、防禦相關基因表現分析 20 1. 引子之設計 20 2. 反轉錄聚合酵素連鎖反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction , RT-PCR) 20 四、分子選殖與序列確認 20 1. DNA 回收與黏合反應 21 2. 大腸桿菌勝任細胞製備 21 3. 大腸桿菌細胞轉形反應 21 4. 菌落PCR 22 5. 序列分析 22 (六) 篩選失去ISR作用之B. cereus C1L突變株 22 一、ISR突變株篩選系統 22 1. 突變株處理液製備 23 2. ISR突變株篩選系統 23 3. ISR突變株保存 23 二、Tn917ac1 插入位置分析 23 1. 桿菌屬細菌全DNA之抽取 24 2. 桿菌屬細菌全DNA之限制酵素切割及回收沉澱 24 3. 片段DNA自我黏合反應與轉形 25 4. 細菌質體 DNA 之小量抽取 25 5. DNA 電泳分析 26 6. 序列分析 26 陸、結果 27 (一) B. cereus C1L之生物防治效果 27 一、B. cereus C1L誘導植物抗病之作用 27 二、溫室防治試驗 27 三、田間防治試驗 (I) 28 四、田間防治試驗 (II) 28 (二) B. cereus C1L對玉米生長之影響 28 (三) B. cereus C1L對玉米葉片葉綠素含量之影響 29 (四) B. cereus C1L對玉米葉片過氧化氫含量之影響 30 (五) 植物防禦相關基因表現之RT-PCR之分析 30 (六) 篩選失去ISR能力之B. cereus C1L突變株 31 一、B. cereus C1L之ISR突變株篩選 31 二、B. cereus C1L之ISR突變株誘變基因分析 32 柒、討論 33 捌、參考文獻 39 玖、圖表集 51 表一、B. cereus C1L不同培養時間之ISR作用 52 表二、B. cereus C1L之ISR作用 53 表三、處理C1L菌液對玉米葉片生長之影響 54 表四、處理C1L菌液對玉米鮮重和乾重之影響 55 表五、玉米基因之引子對序列 56 表六、篩選失去誘發系統性抗病能力之C1L突變株 57 圖一、玉米葉片罹病等級。 63 圖二、溫室試驗處理C1L菌液於玉米根圈對葉枯病之生物防治效果 64 圖三、田間試驗處理B. cereus C1L於玉米根圈對葉枯病之生物防治效果 65 圖四、田間試驗(I)處理B. cereus C1L菌液於玉米根圈對植株生長之影響 66 圖五、田間試驗(II)處理C1L菌液於玉米根圈對植株生長之影響 67 圖六、田間試驗處理C1L菌液對玉米葉片之影響 68 圖七、田間試驗處理B. cereus C1L於玉米根圈對葉片葉綠素含量之影響 69 圖八、玉米葉片過氧化氫含量 70 圖九、處理B. cereus C1L之玉米防禦相關基因表現RT-PCR分析 71 圖十、RT-PCR之核酸序列 73 圖十一、Tn917ac1轉位子插入位置分析 74 圖十二、B. cereus C1L的Tn917ac1突變株周邊序列比對 77 圖十三、突變株M-163中Tn917ac1插入質體pC1L8之位置 781195187 bytesapplication/pdfen-US植物促生根圈細菌臘狀芽孢桿菌玉米玉米葉枯病菌生物防治系統性誘導抗病Plant growth-promoting rhizobacteriaBacillus cereusmaizeCochliobolus heterostrophusbiocontrolinduced systemic resistanceotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/58066/1/ntu-96-R94633020-1.pdf