高全良臺灣大學:醫學檢驗暨生物技術學研究所楊惠茹Yang, Huel-JuHuel-JuYang2010-05-112018-07-062010-05-112018-07-062009U0001-1708200917450300http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/182970A型流行性感冒病毒屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，為單股負鏈RNA病毒，共有八段基因，可以產生十種不同的病毒蛋白質；A型流感病毒根據十六種血球凝集素(H1~H16)及九種神經胺酸酶(N1~N9)再分類為不同亞型，感染人類的A型流感病毒主要以H1N1及H3N2為主。根據台灣疾病管制局之文獻資料，A型流感病毒H1N1在2001/2002年及2005/2006年有流行之高峰；且A/H1N1病毒株為2001/2002年及2005/2006年主要之流感病毒分離株，對此些病毒之基因及生物特性之瞭解甚少，因此本研究針對台灣北部2001及2006、2007年之A/H1N1病毒株進行相關探討分析。研究主要包括兩部份，第一部份為A/H1N1病毒表面醣蛋白質血球凝集素、神經胺酸酶基因分子流行病學之研究；第二部份為對具有大小溶斑病毒形態之A/H1N1病毒之生物學性質進行研究。藉由這些實驗來進一步瞭解NA蛋白質(N1)在流感病毒所扮演之角色，並進一步利用NA蛋白質結構模擬，來討論重要位置之發現對於病毒NA蛋白質和抗流感藥物之結合是否會有影響。 研究結果發現2001年病毒株屬於A/New Caledonia/20/99-like strain，而2006及2007年病毒株則是接近A/Solomon Islands/3/06-like strain，透過A/H1N1臨床病毒株HA及NA基因種系圖分析，可以知道2001、2006及2007年的病毒株分為兩群；而胺基酸序列分析結果也發現2001年病毒株、2006及2007年病毒株的胺基酸序列有一些改變。在神經胺酸酶活性測定的實驗中也發現小溶斑病毒並不一定會完全失去神經胺酸酶的活性，有些小溶斑病毒還是具有感染細胞的能力。接著再針對溶斑實驗所純化出來的大小溶斑病毒進行研究，結果發現6593S 小溶斑病毒神經胺酸酶的第443個胺基酸殘基由Serine改變為Asparagine；此改變的確會造成其神經胺酸酶活性下降，而此一小溶斑病毒透過血球凝集釋出實驗，證明其無法由血球凝集中釋出，實驗結果證明6593S 小溶斑病毒神經胺酸酶第443個胺基酸殘基的改變會影響神經胺酸酶的活性與功能。而進一步透過蛋白質結構模擬分析，可以知道6593S小溶斑病毒神經胺酸酶第443個胺基酸殘基的改變，使得小溶斑病毒神經胺酸酶酵素催化位置和唾液酸及神經胺酸酶抑制藥物之間結合的鍵結有所改變，此結果可和實驗結果相互印證。神經胺酸酶第443個胺基酸殘基的改變會影響神經胺酸酶的活性與功能的發現，仍有待進一步實驗確認。The influenza A virus is a member of the Orthomyxoviridae family. It is a single-stranded RNA virus with envelope. The genome consists of eight RNA fragments and can encode 10 viral proteins. There are 16 H (H1~H16) and 9 N (N1~N9) subtypes. Currently, the H1N1 and H3N2 subtypes are circulating among humans. According to the Center for Disease Control, Taiwan, the A/H1N1 strain reached peak prevalence in the years 2001/2002 and 2005/2006, and was the major strain isolated in the influenza seasons of these years. In order to understand the variation of genetic sequences and biological characteristics of these viruses, this study was focused on the A/H1N1 virus strains isolated in northern Taiwan in the years 2001, 2006, and 2007. The study consists of two parts. The first part includes molecular epidemiological studies, which focus on the surface glycoprotein hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes. In second part, the biological function of A/H1N1 isolates with large or small viral plaques and the role of NA protein (N1) in the virulence of the influenza virus were examined. The structure modeling and the key positions of NA protein were discussed. The results revealed that the dominant strains isolated in 2001 was an A/New Caledonia/20/99-like strain, whereas the strains isolated in 2006 and 2007 was similar to the A/Solomon Islands/3/06 strain. Through phylogenetic analysis of the HA and NA of clinical isolates of the A/H1N1 virus, we found that these strains were clustered into two groups. The correlation between plaque size and neuraminidase activity was not existed. The inconsistent results were also found between the plaque size and the virus growth activity. However, by using plaque purification, there was one unique strain (6593) showed different biological characteristics between small plaques and large plaques. The results showed that the amino acid residue at position 443 of neuraminidase enzyme in the 6593S virus (small plaque) was asparagine ifferent from the serine residue of the large plaque derived from the same parental strain. This change resulted in a decrease in neuraminidase activity. Further, a hemagglutination elution test revealed that the 6593S virus was unable to release from hemagglutinated RBC. Through the protein structure modeling, it was suggested that the change in amino acid residue 443 of neuraminidase might alter the neuraminidase catalytic sites. The variation in neuraminidase structure may interfere the interactions among sialic acid, neuraminidase, and enzyme inhibitor. However, this finding needs to be elucidated by further studies.誌謝………………………………………………………………..........1文摘要………………………………………………………………..3文摘要………………………………………………………………..5一章 緒論……………………………………………………………….121節 歷史……………………………………………………………………….122節 病毒特性及分類………………………………………………………….133節 宿主範圍………………………………………………………………….134節 流行季節及地理分佈…………………………………………………….145節 病毒之基因結構和病毒蛋白…………………………………………….146節 病毒之複製……………………………………………………………….177節 病毒之抗原變異………………………………………………………….188節 流感疫苗………………………………………………………………….199節 流感病毒之治療藥物…………………………………………………….1910節 近年來台灣及其他國家流感病毒之流行概況………………………...2011節 本論文研究目的………………………………………………………...23二章 實驗材料與方法……………………………………………..24.實驗材料………………………………………………………………………..24.實驗方法………………………………………………………………………..27.細胞培養(Cell culture)…………………………………………………...27.臨床A型流行性感冒病毒H1N1分離株之繼代培養(Virus culture)…27.病毒RNA之萃取(Extraction of virus RNA)……………………………28.反轉錄酶反應(Reverse transcriptase reaction,RT:cDNA合成)…………28.聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction)……………………………29.PCR產物之純化(Purification of PCR product)………………………...29.核酸定序(Nucleic acid sequencing)……………………………………..30.核酸及胺基酸序列分析(Nucleic acid and amino acid sequence analysis) …………………………………………………………………………..31.基因種系圖分析(Phylogenetic analysis)………………………………..310.溶斑試驗(Plaque assay)………………………………………………..311.大小病毒溶斑之純化(Purification of large and small plaque)………...322.病毒生長曲線(Virus growth curve)…………………………………....323.血球凝集試驗(Hemagglutination test)………………………………....324.血球凝集釋出試驗(Hemagglutination elution test)……………………335.神經胺酸酶活性試驗 (Neuraminidase activity test)…………………..33三章 結果..........................................................................................34. 2001、2006及2007年台灣北部A型人類流感病毒(H1N1)表面醣蛋白血球凝集素(Hemagglutinin)、神經胺酸酶(Neuraminidase)基因分子流行病學之研究1節 A型人類流感病毒(H1N1)反轉錄聚合酶連鎖反應之產物……………...342節2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1) H1和N1基因種系圖分析…………………………………………………………………………………….343節2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1)之HA蛋白核酸及胺基酸序列分析………………………………………………………………………….........364節2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1)之NA蛋白核酸及胺基酸序列分析……………………………………………………………………………….38. A/H1N1流感病毒株及大小病毒溶斑生物學功能之研究5節 A/H1N1臨床病毒株血球凝集素能力分析………………………………416節 A/H1N1臨床病毒株之神經胺酸酶活性分析……………………………417節 流感病毒大小溶斑(plaque)之純化及培養……………………………….418節 大小溶斑病毒 (6593L、6593S、882L、882S) HA基因及NA基因之核酸產物分析…………………………………………………………..........................429節 大小溶斑病毒(6593L、6593S、882L、882S) HA基因及NA基因之核酸及胺基酸序列分析…………………………………………………………………..4210節 大小溶斑病毒(6593L、6593S、882L、882S)之神經胺酸酶活性分析...4311節 大小溶斑病毒(6593L、6593S)之生長曲線(growth curve)………………4312節 大小溶斑病毒(6593L、6593S、882L、882S)血球凝集釋出試驗……..44四章 討論……………………………………………………………451節A/H1N1人類流感病毒血球凝集素(Hemagglutinin)及神經胺酸酶Neuraminidase)基因之研究………………………………………………………..452節A/H1N1流感病毒株及大小溶斑病毒生物學功能之研究……………….49五章 參考文獻....................................................................................54目錄一H1基因PCR產物洋菜膠電泳結果………………………............................61二N1基因PCR產物洋菜膠電泳結果…………………………………………61三 2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1)臨床流行株和世界衛生組織(World Health Organization,WHO)建議北半球疫苗株H1基因種系圖(1~1067nt)…………………………………………………………………62四 2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1)臨床流行株和世界衛生組織(World Health Organization,WHO)建議北半球疫苗株N1基因種系圖(1~1385nt)…………………………………………………………………63五 2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1)臨床流行株和其他國家病毒株H1基因種系圖(1~845nt)……………………………………………...64六2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1)臨床流行株和其他國家病毒株N1基因種系圖(1~1253nt)………………………………………………..65七 2001、2006及2007年流感病毒株A/H1N1之神經胺酸酶活性分析(NA activity assay)…………………………………........................................66八 A/Taiwan/6593/2001(H1N1)大小病毒溶斑之純化結果…...........................67九 A/Taiwan/882/2006(H1N1)大小病毒溶斑之純化結果…………………….68十 大小溶斑病毒(6593L、6593S、882L、882S)HA基因及NA基因之核酸產物電泳結果………………………………………………………………….69十一 大小溶斑病毒及其母株A/H1N1病毒株之神經胺酸酶活性分析NA activity assay)………………………………........................................70十二 6593大小溶斑病毒之生長曲線(growth curve)………..........................71十三 6593母株(6593P)及其大小溶斑病毒(6593L、6593S)之血球凝集素出試驗(Hemagglutinin elution test)………………………………......72十四 882母株(882P)及其大小溶斑病毒(882L、882S)之血球凝集素釋出驗(Hemagglutinin elution test)………………………………………..73十五 小溶斑病毒神經胺酸酶(6593 Small N1)與唾液酸(Sialic acid)之結構擬分析…………………………………………………………………74十六 小溶斑病毒神經胺酸酶(6593 Small N1)與神經胺酸酶抑制藥物之構模擬分析……....................................................................................75rotein structure modeling further interpretation…………………………………..77目錄一 2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1)HA蛋白核酸及胺基酸序列相度(identity)………………………………………………….......................80二 A/H1N1病毒株HA蛋白受體結合位置(receptor-binding sites)胺基酸殘基分……………………………………………………………………………..81三 A/H1N1臨床病毒株之血球凝集能力分析………………………………...82四 HA(H1)蛋白之抗原位置，共分為4個部份(Ca、Cb、Sa、Sb)及其胺基酸殘位置……………………………………………………………………...83五 HA(H1)蛋白之抗原位置Site Ca之胺基酸殘基分析……………………..84六 HA(H1)蛋白之抗原位置Site Cb之胺基酸殘基分析……………………..85七 HA(H1)蛋白之抗原位置Site Sa之胺基酸殘基分析………......................86八 HA(H1)蛋白之抗原位置Site Sb之胺基酸殘基分析……………………..87九 HA(H1)蛋白之醣化位置(Glycosylation sites)分析………………………..88十 2001、2006及2007年人類流感病毒(A/H1N1)NA蛋白核酸及胺基酸序列似度(identity)………………………………........ ………………………89十一 NA(N1)蛋白之抗原位置胺基酸殘基分析…………………………….90十二 NA(N1)蛋白酵素活化位置之催化位置(Catalytic sites)胺基酸殘基析……………………………………………………………………..91十三 NA(N1)蛋白酵素活化位置之結構上骨架(Framework sites)胺基酸基分析………………………………………………………………..92十四 NA(N1)蛋白醣化位置(Glycosylation sites)之胺基酸殘基分析………93十五 大小溶斑病毒(6593L、6593S、882L、882S)與母株病毒之HA基因酸相似度分析………………………………………………………..94十六 大小溶斑病毒(6593L、6593S、882L、882S)與母株病毒之NA基因酸相似度分析………………………………………………………..94十七 大小溶斑病毒(6593L、6593S、882L、882S) 與母株之HA蛋白基酸相似度及改變位置分析………………………………………..95十八 大小溶斑病毒(6593L、6593S、882L、882S) 與母株之NA蛋白基酸相似度及改變位置分析……………………………………….95application/pdf2463341 bytesapplication/pdfen-USA型流行性感冒病毒H1N1大及小溶斑病毒神經胺酸酶活性influenza A viruslarge and small plaque virusneuraminidase activity[SDGs]SDG3http://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/182970/1/ntu-98-R94424007-1.pdf