何蘊芳臺灣大學：臨床藥學研究所林怡君Lin, Yi-ChunYi-ChunLin2007-11-272018-07-092007-11-272018-07-092006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/55418Tetrahydrobiopterin（BH4）屬人體之內生性物質，其重要生理功能之ㄧ係做為體內某些胺基酸代謝所需之輔酶，參與神經傳導物質dopamine與serotonin生合成之過程，缺乏時將會導致體內特定胺基酸與神經傳導物質dopamine、serotonin平衡失調，稱為tetrahydrobiopterin缺乏症（tetrahydrobiopterin deficiency，BH4 deficiency）。Tetrahydrobiopterin缺乏症為國內衛生署公告罕見疾病之一，臨床上和幼童發育遲緩有密切之關係，早期的診斷與治療對病患有相當大的助益。目前國內臨床上尚無常規直接檢測腦脊髓液中pterins相關物質含量之措施，本研究擬以高效液相層析法及液相層析串聯質譜分析方法，期建立適當的分析條件，以應用於病患腦脊髓液檢體之檢測。 本研究探討不同緩衝溶液、pH 值及流速對高液相層析方法分離效果之影響；並將電化學提供電位由低至高尋找出最適宜偵測BH4之電位。液相層析串聯質譜方法則依據化合物之分子量，設定適當之參數測量。 本研究所建立分析pterins之方法可分為三個部份： 第一部份以高效液相層析法同時測定neopterin與biopterin：分析使用5 μm逆相碳18管柱（150 × 4.6 mm I.D.），移動相為5 mM檸檬酸緩衝溶液，pH調整為5.2，螢光偵測設定激發波長350 nm，放射波長448 nm，流速為0.5 mL/min。偵測極限可達200 pg（20 nM，5 ng/mL，40 μL）。 第二部分仍以高效液相層析法測定BH4：分析使用5 μm逆相碳18管柱（150 × 4.6 mm I.D.），移動相為10 mM磷酸緩衝溶液，pH調整為2.5，電化學偵測設定700 mV，流速0.4 mL/min。偵測極限可達80 pg（6.4 nM，2 ng/mL，40 μL）。 第三部份為以液相層析串聯質譜儀方法同時測定neopterin、biopterin、BH2與BH4：分析使用5 μm逆相碳18管柱（250 × 4.6 mm I.D.），移動相為5％甲醇，pH調整為2.5。偵測極限最低可達1 pg（0.4 nM，0.1 ng/mL，10 μL）。 本研究進一步以上述建立之方法應用於病患檢體檢測。在西元2004年11月10日至2005年12月31日期間，共納入台大醫院小兒科門診或住院病患中有發育遲緩現象病童54名，收集其腦脊髓液檢體保存以待測量。 病患檢體以高效液相層析串聯質譜分析，皆無可測得之neopterin、biopteirn、BH4或BH2波峰，或許是由於大部份國人腦脊髓液中這些pterins的含量較低，導致測不出pterins含量。因此未來宜進行人數更多、規模更大之檢測，以期建立國內小兒腦脊髓液中pterins相關物質之參考範圍及病患之致病範圍，藉以做為診斷BH4缺乏症之依據，並可進一步用於監測其治療控制之情形。Tetrahydrobiopterin (BH4) is an endogenous factor in human body, one of its important functions is to act as a coenzyme for certain amino acid hydroxylases. Tetrahydrobiopterin participates in the synthesis of neurotransmitters such as dopamine and serotonin. Deficiency in BH4 will lead to the disturbance of homeostasis of certain amino acids in the body, especially dopamine and serotonin, and is called tetrahydrobiopterin deficiency (BH4 deficiency). Tetrahydrobiopterin deficiency is one of the Department of Health-declared rare diseases in Taiwan. Clinically, it correlates closely with developmental delays in children. Early diagnosis is beneficial for victims. Presently, there is no analytical method applied routinely to measure the amount of pterins in cerebrospinal fluids in Taiwan. The present study tried to employ and optimize applicable analytical conditions, including buffer systems, pH value, flow rate, and voltage (electrochemical detection), by using high-performance liquid chromatography (HPLC) and liquid chromatography/ tandem mass spectrometry (LC/MS-MS). The application of suitable assay methods to the measurement of patients’ cerebrospinal fluid (CSF) samples was also attempted. The established analytical conditions in the study are as follows: The first was for the simultaneous detection of neopterin and biopterin by reversed-phase HPLC with fluororescence detector. Chromatographic conditions were as follows: column 150 x 4.6 mm packed with 5 μm C18, mobile phase 5 mM citric buffer, pH adjusted to 5.2, flow rate 0.5 mL/min, excitation wavelength 350 nm and emission wavelength 448 nm. The detection limit was 200 pg. The second was for the determination of BH4 by using reversed-phase HPLC with electrochemical detector. Chromatographic conditions were as follows: column 150 x 4.6 mm packed with 5 μm C18, mobile phase 10 mM phosphoric buffer, pH adjusted to 2.5, flow rate 0.4 mL/min, applied voltage was 700 mV. The detection limit was 80 pg. The third was for the simultaneously detection of neopterin, biopterin, BH4, and BH2 by utilizing LC/MS-MS, using reversed-phase 5 μm C18 column ( 250 x 4.6 mm, I.D.) for separation. The mobile phase consisted of 5% methanol in water (pH 2.5), with a flow-rate of 0.8 mL/min. The detection limit was 1 pg. The analytical methods described above were applied to the assay of human CSF samples. During Nov. 10, 2004 to Dec. 31, 2005, fifty-four patients with developmental delays were recruited into the study from the outpatient and inpatient services of the NTUH Department of Pediatrics. CSF samples were collected for analysis. Results showed that neopterin, biopterin, BH4, and BH2 were not detectable in all CSF samples by employing LC/MS-MS, even though our detection limit was comparable to previous Western reports. One possible explanation is that the CSF pterin levels of our population was significantly lower than the Caucasian population and, thus, the quantification was hampered by undesirable detection limit. For aiding in the diagnosis, treatment, and monitoring of BH4 deficiency and therapy, larger-scale trials with both healthy and diseased subjects are needed for setting up reference values for our population in the future.摘要…. I Abstract .. IV 圖目錄 IX 表目錄 XI 縮寫及全稱對照表 XII 第一章 文獻探討 1 第一節 前言 1 第二節 Tetrahydrobiopterin之生理功能及作用 4 第三節 Tetrahydrobiopterin之生合成及轉換 6 第四節 Phenylketonuria 10 第五節 Tetrahydrobiopterin缺乏症 13 第六節 體液中Pterins含量與其他疾病相關性之研究 19 第七節 Tetrahydrobiopterin及相關化合物之物性及化性資料 21 第八節 Tetrahydrobiopterin之HPLC分析方法 24 第二章 動機與目的 32 第三章 實驗試劑與儀器 33 第一節 實驗藥品與試劑 33 第二節 實驗儀器 34 第四章 實驗方法 36 第一節 Tetrahydrobiopterin最適定量條件建立 36 第二節 Neopterin及Biopterin最適定量條件之建立 38 第三節 Neopterin、Biopterin與BH4之HPLC分析方法 40 第四節 HPLC分析方法之確效 41 第五節 運用LC/MS-MS方法定量Pterins 43 第六節 HPLC與LC/MS-MS分析方法應用於人類腦脊髓液檢體之上 45 第五章 結果 47 第一節 Tetrahydrobiopterin之HPLC測定結果 47 第二節 Neopterin與Biopterin之HPLC測定結果 53 第三節 HPLC分析條件之整理 58 第四節 HPLC測定Neopterin與Biopterin之確效 59 第五節 LC/MS-MS測定Pterins之結果 62 第六節 測定人類腦脊髓液內Pterins之結果 66 第六章 討論 70 第一節 HPLC分析方法之建立 70 第二節 分析方法之比較 72 第三節 偵測極限之探討 76 第四節 高效液相層析方法之研究限制 77 第七章 結論及未來方向 79 第八章 參考文獻 80 附錄 臨床試驗計畫申請通過文件 91 圖目錄 圖 1- 1BH4在特定胺基酸代謝所扮演的角色 4 圖 1-2 Pteridine、pterin與biopterin化學構造式 6 圖 1- 3、BH4的生合成步驟簡圖 7 圖 1- 4 BH4的生合成步驟詳圖 9 圖4-1 標準溶液之配製與前處理 44 圖4-2檢品前處理步驟與分析流程 46 圖 5-1高效液相層析圖，在電位700 mV，流速1 mL/min下於各類緩衝溶液系統中分析濃度50 ng/mL之BH4，b之分離效果最佳 48 圖 5-2測定電位與BH4層析峰下面積之關係，從100 mV測到900 mV，電位越大，層析峰下面積亦越大 49 圖 5-3 高效液相層析圖，電化學偵測器設定電位600∼900 mV測定濃度2.2 µg/mL 之BH4。電位越大，雜訊亦越大 49 圖 5- 4高效液相層析圖，不同流速下以電化學偵測器測定BH4，流速越慢分離效果越好，但層析鋒會擴散開來 51 圖 5-5高液相層析圖，以移動相做檢品自動注入系統之清洗液測定BH4，影響訊號消失了 52 圖 5-6 Neopterin與biopterin之紫外光吸收，紫外光波長由300 nm到500 nm，最大值在344 nm 53 圖 5-7 Neopterin與biopterin在激發波長344 nm放射波長370-520 nm之間所放射之螢光強度圖，最大在448 nm 54 圖 5-8 比較激發波長344 nm與350 nm之螢光放射強度 55 圖 5-9 高效液相層析圖，不同緩衝溶液中以螢光偵測器測定濃度各為50 ng/mL之neopterin與biopterin。緩衝溶液a分離效果最佳 56 圖 5-10高效液相層析圖，不同流速下以螢光偵測器測定濃度為50 ng/mL之neopterin與biopterin 流速越低，層析峰下面積越大，波峰越擴散 57 圖 5-11 高效液相層析圖，以螢光偵測器測定濃度5 ng/mL之neopterin與biopterin，為neopterin與biopterin之定量與偵測極限 61 圖 5-12 高效液相層析串聯質譜之層析圖，由上至下為濃度1 ng/mL之neopterin、BH4、biopterin與三者之總和 62 圖 5-13 高效液相層析串聯質譜之層析圖，由上至下為濃度0.5 ng/mL之neopterin、BH4、biopterin與三者之總和 63 圖 5-14 高效液相層析串聯質譜之層析圖，由上至下為濃度0.1 ng/mL之neopterin、BH4、biopterin與三者之總和 63 圖 5-15 高效液相層析串聯質譜之層析圖。（BH2濃度為1 ng/mL） 64 圖 5-16 高效液相層析串聯質譜之層析圖。（BH2濃度為0.5 ng/mL） 64 圖 5-17 高效液相層析串聯質譜之層析圖。（BH2濃度為0.1 ng/mL） 65 圖 5- 18 Folic acid 67 圖 5- 19 Folinic acid 67 圖 5- 20 Methotrexate 67 圖 5- 21 Trimethoprim 68 圖 5-22 高效液相層析串聯質譜之層析圖，腦脊髓液檢體來自發育遲緩之13歲男孩 69 圖 5-23 高效液相層析串聯質譜之層析圖，腦脊髓液檢體來自發育遲緩並有癲癇症之9個月大女嬰 69 表目錄 表1- 1衛生署公告之十八類罕見疾病 1 表1- 2特定內生性胺類缺乏的相關症狀 13 表1- 3 不同型式BH4缺乏症尿液中pterins類氧化產物之含量 15 表1-4體液中pterins濃度參考範圍 17 表1- 5 修改自BIODEF資料庫各型式BH4缺乏症與PKU之生化數值 18 表1- 6 Neopterin、biopterin、BH4與BH2之化學特性 21 表1- 7 國內核可之tetrahydrobiopterin藥品劑型與含量 23 表1- 8不同研究中抗氧化之方式 24 表1- 9保存方式對BH4標準溶液及CSF中BH4濃度之影響 25 表1- 10各研究螢光偵測條件設定之比較 29 表4-1本研究用層析管柱特性 36 表4-2各緩衝溶液之條件比較 37 表4-3 各緩衝溶液系統之條件比較 39 表5-1不同分析流速下層析峰滯留時間 50 表5-2分析不同緩衝系統所使用之pH值與流速 56 表5- 3 HPLC分析條件設定值 58 表5-4 Neopterin同日內與異日間精確度與準確度試驗結果 59 表5-5 Biopterin同日內與異日間精確度與準確度試驗結果 60 表5-6 Neopterin、biopterin、BH4與BH2之偵測極限 65 表5-7 Neopterin、biopterin、BH4與BH2之滯留時間 681076985 bytesapplication/pdfen-US發育遲緩罕見疾病Tetrahydrobiopterindevelopmental delay[SDGs]SDG3texthttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/55418/1/ntu-95-R92451009-1.pdf