陳昭岑臺灣大學：化學研究所李育瑾Li, Yu ChinYu ChinLi2007-11-262018-07-102007-11-262018-07-102004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/51779大腸桿菌 (E. Coli) 的十一異戊二烯焦磷酸合成酶 (UPPs ，undecaprenyl pyrophosphate synthase) 能催化連續的縮合反應，將一個法呢焦磷酸酯 (FPP，farnesyl pyrophosphate) 與八個異戊二烯焦磷酸酯 (IPP，isopentenyl pyrophosphate) 縮合成一個C55 UPP。UPP為大腸桿菌lipid Ⅱ的載體，可將之翻轉出細胞膜外繼而繼續進行合成細胞壁。 我們成左漲X成出四個帶有螢光基團的FPP螢光類似物：14 (NBD-FPP)、24 (fluorescein-FPP)、34 (MANT-ESTER-FPP)、44 (MANT-AMIDE-FPP)。利用穩定狀態螢光光譜儀得到四種類似物自身的光學特性，並利用其光學特性觀察與UPPs結合的情況，及利用螢光滴定實驗求得類似物與UPPs的解離常數Kd；另外也利用了酵素動力學實驗，求出四種類似物對UPPs的抑制常數Ki和半抑制濃度IC50。 結果化合物24的抑制能力最好，且因為與UPPs結合前後螢光強度改變，所以可利用其特性在生物體內細胞的作造影成像。化合物34能成為不錯的FPP替代物，且因為Kd夠小，可利用來作為UPPs抑制藥物的篩選。而化合物14、24、34、44都將可能發展成為研究各種不同FPP-binding酵素的工具和作為高速篩選的探針。Undecaprenyl pyrophosphate synthase (UPPs) of E. Coli. catalyzes the condensation of eight molecules of isopentyl pyrophosphate (IPP) with farnesyl pyrophosphate (FPP) to generate C55 undecaprenyl pyrophosphate, which serves as a carrier in transporting lipid II across the membrane in bacterial cell wall biosythesis. We successively synthesized four FPP fluorescent analogues: 14 (NBD-FPP), 24 (fluorescein-FPP), 34 (MANT-ESTER-FPP) and 44 (MANT-AMIDE-FPP). We obtained spectroscopic characterization of four analogues by steady-state fluorescence spectrophotometer, and we utilized those to observe the ligand interactions with UPPs. And we also got different kinetic parameters of four analogues. 24 has the best competitive inhibition, and when binding with UPPs, the difference of fluorescent intensity can be seen by eyes. 34 can serve as alternative substrate for UPPs, and could be used as drug screening. Analogues 14, 24, 34, 44 could be used to study different FPP-binding proteins and served as high throughput probes.目錄………………………………………………………………………I 圖目錄…………………………………………………………………IV 表目錄…………………………………………………………………VII 化學符號縮寫………………………………………………………VIII 中文摘要………………………………………………………………IX 英文摘要………………………………………………………………X 第一章緒論………………………………………………………………1 1.1 前言………………………………………………………………1 1.1.1 異戊二烯焦磷酸合成酶的介紹………………………………2 1.1.2 蛋白質異戊二烯轉移酶的介紹………………………………5 1.1.3 萜類環化酶的介紹……………………………………………7 1.2 十一異戊二烯焦磷酸合成酶 (UPPs) 的介紹……………………9 1.2.1 UPPs與基質結合的結構分析………………………………11 1.2.2 UPPs催化IPP和FPP縮合的可能反應機構推測…………13 1.2.3 UPPs的構形變化研究………………………………………14 1.3 螢光探針的介紹…………………………………………………16 1.3.1 螢光基團的螢光發光機制…………………………………16 1.3.2 螢光基團的特性、選擇及介紹……………………………18 第二章 FPP螢光類似物的合成………………………………………26 2.1 FPP螢光類似物的逆合成分析…………………………………26 2.2 FPP螢光類似物合成方法的探討………………………………29 第三章 結果與討論……………………………………………………39 3.1 化合物14的實驗與討論…………………………………………39 3.1.1 化合物14的光學性質……………………………………39 3.1.2 化合物14與UPPs的酵素動力學實驗……………………41 3.1.3 化合物14的螢光滴定實驗………………………………42 3.1.4 化合物14與IPP的反應產物………………………………43 3.1.5 化合物14與UPPs的模擬分析……………………………44 3.1.6 結論…………………………………………………………47 3.2 化合物24的實驗與討論………………………………………47 3.2.1 化合物24的光學性質……………………………………47 3.2.2 化合物24在不同pH值的緩衝溶液下的螢光測試………49 3.2.3 化合物24與UPPs的酵素動力學實驗……………………50 3.2.4 化合物24的螢光滴定實驗…………………………………51 3.2.5 化合物24與IPP的反應產物………………………………56 3.2.6 化合物24與UPPs的模擬分析………………………………53 3.2.7 結論…………………………………………………………59 3.3 化合物34的實驗與討論…………………………………………59 3.3.1 化合物34的光學性質………………………………………59 3.3.2 化合物34與UPPs的酵素動力學實驗………………………60 3.3.3 化合物34的螢光滴定實驗…………………………………61 3.3.4 UPPs與化合物34間FRET現象的原理及探討……………69 3.3.5 化合物34與IPP的反應產物………………………………73 3.3.6 化合物34與UPPs的模擬分析………………………………74 3.3.7 結論…………………………………………………………76 3.4 化合物44的實驗與討論…………………………………………76 3.4.1 化合物44的光學性質………………………………………76 3.4.2 化合物44與UPPs的酵素動力學實驗………………………77 3.4.3 化合物44的螢光滴定實驗…………………………………78 3.4.4 化合物44與IPP的反應產物…………………………………79 3.4.5 化合物44與UPPs的模擬分析………………………………80 3.4.6 結論…………………………………………………………81 第四章 總結……………………………………………………………83 實驗部份………………………………………………………………85 一、一般敘述………………………………………………………85 二、合成步驟及光譜數據…………………………………………87 參考文獻………………………………………………………………10610447913 bytesapplication/pdfen-US法呢焦磷酸酯螢光類似物十一異戊二烯焦磷酸合成酶Farnesyl Pyrophosphate Fluorescent AnaloguesUndecaprenyl Pyrophosphate Synthasethesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/51779/1/ntu-93-R91223037-1.pdf