2010-02-272024-05-17https://scholars.lib.ntu.edu.tw/handle/123456789/684220摘要：為提升蝴蝶蘭植株抗細菌性軟腐病的能力，本計畫將蝴蝶蘭軟腐病原之果膠分解酶 (pectate lyase) 基因 pelZ，以農桿菌媒介法轉殖入蝴蝶蘭癒合組織，期望培育出具抗病能力之蝴蝶蘭品種。轉殖後經抗生素篩選存活之癒合組織，持續篩選及純化後，確定 11 個轉殖細胞系含有 pelZ 基因表現，進一步培養長大之蝴蝶蘭 擬轉殖株，抽取轉殖株葉片之總蛋白，以西方轉漬法偵測到預期的 49 kDa 表達蛋白，證實轉殖株確有目標蛋白表現。又，之前轉殖軟腐病原之果膠分解酶基因pelE-1 之蝴蝶蘭癒合組織轉殖系，進一步轉殖 pelZ 基因，經抗生素hygromycin篩選後，進行擬轉殖植株的再生，經 GUS 活性組織化學染色分析，已取得具有雙重轉殖基因的蝴蝶蘭轉殖系。為減少抗生素篩選使用之疑慮，已將水稻 EPSP 合成酶突變基因轉殖至蝴蝶蘭癒傷組織，另為移除篩選標誌基因，利用 Transposon 系統進行構築，亦已轉殖至蝴蝶蘭癒傷組織，於含有 1 mM 之 Glyphosate 的培養基篩選中。今年度之工作項目包括：1. 以源自植物之非抗生素抗性基因作為篩選標誌，進行蝴蝶蘭癒傷組織之基因轉殖，隨後利用嘉磷塞進行篩選，並持續繼代培養以取得均質的蝴蝶蘭轉殖細胞系。將純化之轉殖蝴蝶蘭細胞系再生成植株後，進行分子驗證，以GUS 活性組織化學染色、聚合酶連鎖反應及南方氏雜交分析，確認轉殖成功。2. 為避免果膠分解酶基因大量表現可能影響到轉殖株之生長，進一步利用可受水楊酸誘導之 PR1a 基因啟動子，連接軟腐病原之果膠分解酶基因 pelE-1，構築為誘導性表現質體，以農桿菌轉殖法進行蝴蝶蘭癒傷組織之基因轉殖，經抗生素篩選取得純化之轉殖細胞系後，進行再生以取得轉殖株。蝴蝶蘭無篩選標誌系統細菌性軟腐病PhalaenopsisMarker-Free SystemBacterial Softrot