張鴻民吳瑞碧臺灣大學：董靜馨Tung, Ching-hsinChing-hsinTung2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56347為瞭解市售燕窩品質，本研究利用燕窩成分特性鑒別燕窩之真偽。以顯微鏡鑒別燕窩形態，發現燕窩在顯微鏡下呈現無色透明、長方形或不規則的碎片，在表面及斷面處有細密的平行紋理，有的表面密佈細小圓孔或細顆粒狀物。市售乾品燕窩，粗蛋白質含量介於 52.1∼63.4%。燕窩乾燥粉末經酸水解，dansyl chloride 衍生化後，以毛細管電泳分析燕窩胺基酸組成。燕窩乾燥粉末以10％ tetramethyl- ammonium hydroxide 溶液70℃ 加熱溶解，以毛細管電泳分析燕窩及其摻偽品豬皮及魚膘的蛋白質指紋圖譜，乾品燕窩在15-23分鐘遷移時間區間含有六根特定波峰，與燕窩之摻偽品豬皮及魚膘有明顯不同，可有效鑒別燕窩真偽。利用 SDS 膠體電泳分析蛋白質分子量，以Bio-safe Coomassie stain 及PAS (periodic acid stain) 醣蛋白染色法進行染色，發現燕窩在SDS 膠體電泳呈現6∼7條譜帶，而且幾乎均是醣蛋白。 燕窩乾燥粉末以三氟醋酸（trifluoroacetic acid）將唾液酸、中性糖及糖胺水解後，以高效離子液相層析儀-脈衝式電流檢出器(High performance ion liquid chromatography with pulsed amperometric detector, HPAE-PAD) 分析燕窩中醣類的組成，燕窩醣蛋白之醣類組成平均含量， Fuc 0.44%， Rha 0.20%， GalN 4.2%， GlcN 5.3%， Gal 5.0% ，Man 0.75% 及 N-acetylnuraminic acid (Neu5Ac) 11.4%。本研究利用唾液酸換算冰糖燕窩產品中燕窩的含量，以Neu5Ac/GalN比值表示冰糖燕窩產品的品質。對照組乾品燕窩之 Neu5Ac/GalN比值為2.3-3.0，20件冰糖燕窩產品之Neu5Ac/GalN比值為0.03∼3.0。In order to gain insights into the qualities of bird’s nests found in local market nowadays, the components of various bird’s nest samples were used in this study to determine their authenticity. Optical microscopy of various types of dried bird’s nest samples showed that they are colorless and transparent, and their shapes are rectangular or irregular fragments. The cross-section profile of bird’s nets has closely-spaced parallel texture, and some have densely-distributed tiny round holes or tiny granulates on their surface. Commercially available dried bird’s nests typically contain 52.1~63.4% of crude protein. Dried bird’s nest powder was easily hydrolyzed in acid. The protein hydrolysate were then derivatized with dansyl chloride, and analyzed by capillary eletrophoresis (CE). Dried bird’s nest powder was dissolved in 10% tetramethyl- ammonium hydroxide solution, heated at 70℃, and analyzed by CE. Six characteristic peaks of major protein components of bird’s nest were found in the interval of 15-23 min migration time, whereas the adulterant pork skin and isinglass did not show these six peaks. Thus, CE analysis of protein profile was found to be an efficient technique to determine the bird’s nest authenticity. Protein molecular weight was analyzed by using SDS PAGE, where gels were stained by the Bio-safe Coomassie stain and PAS (periodic acid stain). There were found 6~7 bands in the SDS PAGE for bird’s nests; moreover, most of them were glycoproteins. Trifluoroacetic acid was used to hydrolyze sialic acid, neutralsugars and aminosugars of bird’s nests, and then the hydrolysates were analyzed by high performance ion liquid chromatography with pulsed amperometric detector (HPAE-PAD). The results showed that the glycoproteins of bird’s nests contain 0.44% of fucose, 0.2% rhamnose, 4.2% galactosamine, 5.3% glucosamine, 5.0% galactose, 0.75% mannose and 11.4% N-acetylnuraminic acid(Neu5Ac). In this research, bird’s nest content of “bird’s nest in rock sugar syrup” products was assessed by converting it into its sialic acid equivalent. The Neu5Ac/GalN ratio signifies quality of the “bird’s nest in rock sugar syrup” products. The Neu5Ac/GalN ratio of control bird’s nest was 2.3-3.0, while for 20 specimens of “bird’s nests in rock sugar syrup”, Neu5Ac/GalN ratios ranged from 0.03 to 3.0.中文摘要 ……………………………………………………………Ⅰ 英文摘要 ……………………………………………………………Ⅱ. 目錄 …………………………………………………………………Ⅳ 表次 …………………………………………………………………Ⅶ 圖次 …………………………………………………………………ⅠⅩ 常用縮寫 …………………………………………………………… ⅩⅠⅠ 第一章 文獻整理 ……………………………………………………1 壹、 燕窩……………………………………………………………1 一、 燕窩之醫藥性 ……………………………………………1 二、 燕窩產地來源 ……………………………………………2 三、 商品規格 …………………………………………………4 四、 燕窩醣蛋白的末端寡醣結構分析 ………………………6 五、 燕窩攙偽品 ………………………………………………8 貳、 醣蛋白 ………………………………………………………10 一、 醣蛋白的功能………………………………………… 10 二、 醣蛋白所含有糖的種類…………………………………12 三、 醣蛋白的分類……………………………………………15 參、 唾液酸 ………………………………………………………23 一、 唾液酸的多樣性…………………………………………23 二、 唾液酸在生理上的意義…………………………………25 三、 唾液酸的代謝 …………………………………………26 四、 人類與其他動物唾液酸表現的不同 …………………28 肆、 醣蛋白分析 …………………………………………………30 一、 毛細管區帶電泳法………………………………………31 二、 微胞電動毛細管層析法…………………………………31 三、 毛細管凝膠電泳法………………………………………32 四、 毛細管等電聚焦法………………………………………32 五、 以毛細管電泳分析蛋白質指紋圖譜……………………33 六、 唾液酸的定量分析………………………………………35 研究目的 ……………………………………………………………36 第二章、 材料與方法………………………………………………37 壹、 實驗材料 ……………………………………………………37 貳、 化學試藥及器材 ……………………………………………37 一、 顯微鏡鑑別………………………………………………37 二、 粗蛋白質分析……………………………………………37 三、 胺基酸分析………………………………………………37 四、 毛細管電泳分析蛋白質指紋圖譜………………………38 五、 SDS膠體電泳分析 ………………………………………38 六、 糖類含量之測定…………………………………………39 參、 實驗方法 ……………………………………………………41 一、 檢體前處理 ……………………………………………41 二、 顯微鏡鑑別 ……………………………………………41 三、 粗蛋白質分析 …………………………………………41 四、 胺基酸分析 ……………………………………………42 五、 毛細管電泳分析蛋白質指紋圖譜 ……………………45 六、 SDS膠體電泳分析 ……………………………………46 七、 HPAE-PAD測定中性糖及糖胺含量……………………51 八、 唾液酸測定……………………………………………53 第三章、 結果與討論………………………………………………55 壹、 顯微鏡鑑別…………………………………………………55 貳、 粗蛋白質分析………………………………………………56 參、 胺基酸分析…………………………………………………57 肆、 毛細管電泳分析蛋白質指紋圖譜…………………………59 伍、 SDS 膠體電泳………………………………………………60 陸、 中性糖及糖胺的含量測定…………………………………62 柒、 唾液酸測定…………………………………………………64 捌、 冰糖燕窩中燕窩含量計算…………………………………65 第四章、 結論 ……………………………………………………66 第五章、參考文獻…………………………………………………116 表次 表1-1常見燕窩的來源之金絲燕之品種……………………………3 表1-2 醣蛋白的功能 …………………………………………………11 表1-3 醣蛋白的寡醣鏈所具有的功能 ………………………………12 表1-4 出現於人體醣蛋白的主要單醣 ………………………………13 表1-5 醣蛋白的分類 …………………………………………………15 表1-6 參與單醣進程與碳水化合物組合之酵素 ……………………19 表1-7 毛細管電泳之應用模式 ………………………………………30 表1-8 以毛細管電泳分離醣蛋白之條件一覽表 ……………………34 表2-1 12件乾品燕窩來源 …………………………………………68 表2-1 20件冰糖燕窩來源 …………………………………………69 表3-1燕窩及摻偽品的顯微鏡鑑別……………………………………70 表3-2 比較乾品燕窩粗蛋白質之含量 ………………………………71 表3-3比較冰糖燕窩粗蛋白質之含量…………………………………72 表3-4 冰糖燕窩的總固形物、粗蛋白質、價格及真偽…………………73 表3-5 以Dansyl chloride 衍生化胺基酸在毛細管電泳下遷移時間 74 表3-6 乾品燕窩、木耳和豬皮中粗蛋白含量與Val, Pro, Phe, Tyr及 Hyp比值 …………………………………………………………75 表 3-7 燕窩蛋白質在毛細管電泳下遷移時間(214 nm) ………………76 表 3-8 燕窩蛋白質在毛細管電泳下遷移時間(280 nm) ………………76 表 3-9 乾品燕窩之中性糖及糖胺含量比較 ……………………………77 表 3-10 摻偽品之中性糖及糖胺含量比較………………………………78 表 3-11 冰糖燕窩之中性糖及糖胺含量比較……………………………79 表 3-12乾品燕窩之唾液酸含量比較 ……………………………… 80 表 3-13冰糖燕窩之唾液酸含量比較 ……………………………… 81 表 4-1燕窩成分的各種檢驗方法之特性比較 …………………… 82 圖次 圖1-1常見燕窩商品規格.………………………………………………5 圖1-2 金絲燕屬黏蛋白寡醣-醛糖醇結構 ……………………………6 圖1-3 哺乳動物的醣蛋白中常見單醣的化學結構 …………………14 圖 1-4 O-連醣蛋白生合成 “核心結構” 之途徑 ………………17 圖 1-5 N-連醣蛋白生合成途徑………………………………………18 圖 1-6 自然產生的唾液酸家族………………………………………25 圖 1-7 唾液酸生合成簡圖……………………………………………26 圖3-1 乾品燕窩在顯微鏡下的形態(BN.1) …………………………83 圖3-2乾品燕窩在顯微鏡下的形態(BN.4) …………………………83 圖3-3乾品燕窩在顯微鏡下的形態(BN.5) …………………………84 圖3-4乾品燕窩在顯微鏡下的形態(CP.2) …………………………84 圖3-5 豬皮在顯微鏡下的形態 ………………………………………85 圖3-6 魚膘在顯微鏡下的形態 ………………………………………85 圖3-7 木耳在顯微鏡下的形態 ………………………………………86 圖3-8 洋菜在顯微鏡下的形態 ………………………………………86 圖3-9海藻酸鈉在顯微鏡下的形態……………………………………87 圖3-10燕石在顯微鏡下的形態 ………………………………………87 圖3-11 冰糖燕窩在顯微鏡下的形態(S.1) …………………………88 圖3-12 冰糖燕窩在顯微鏡下的形態(S.2) …………………………88 圖3-13 冰糖燕窩在顯微鏡下的形態(S.5) …………………………89 圖3-14 Dansyl chloride 衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜……90 圖3-15 水解乾品燕窩經Dansyl chloride 衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜（BN.1） …………………………………………………………91 圖3-16 水解豬皮經Dansyl chloride衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜 ……………………………………………………………………92 圖3-17 水解魚膘經Dansyl chloride衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜 …………………………………………………………………………93 圖3-18 水解木耳經Dansyl chloride衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜 …………………………………………………………………………94 圖3-19 Dansyl chloride 衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜(A)洋菜(B)海藻酸鈉(C)冰糖燕窩（S.3） …………………………………95 圖3-20 Dansyl chloride 衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜(A)乾品燕窩（BN.1）(B)冰糖燕窩（S.1）…………………………………96 圖3-21 Dansyl chloride 衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜(A)豬皮(B)冰糖燕窩（S.5）…………………………………………………97 圖3-22 Dansyl chloride 衍生化胺基酸之毛細管電泳圖譜(A)木耳(B)冰糖燕窩（S.15） ………………………………………………98 圖3-23 乾品燕窩蛋白質之毛細管電泳圖譜（BN.1）(214 nm) …99 圖3-24蛋白質之毛細管電泳圖譜(A)乾品燕窩（BN.1）(B) 魚膘(C) 豬皮(214 nm) ………………………………………………………100 圖3-25乾品燕窩蛋白質之毛細管電泳圖譜(BN.1) (280 nm) ……101 圖3-26蛋白質之毛細管電泳圖譜(A)乾品燕窩（BN.1）(B) 魚膘(C) 豬皮 (280 nm)………………………………………………………102 圖3-27蛋白質之毛細管電泳圖譜(A)乾品燕窩（BN.1）(B)冰糖燕窩（S.2） ………………………………………………………………………103 圖3-28蛋白質之毛細管電泳圖譜(A) 魚膘(B) 豬皮(C)冰糖燕窩（S.5）(214 nm) ……………………………………………………104 圖3-29 乾品燕窩蛋白質以10％ SDS膠體電泳分析圖譜，Bio-safe Coomassie 染色。……………………………………………………105 圖3-30 乾品燕窩蛋白質以10％ SDS膠體電泳分析圖譜，Bio-safe Coomassie 染色。……………………………………………………106 圖3-31 乾品燕窩蛋白質以10％ SDS膠體電泳分析圖譜，PAS 糖染色法。 …………………………………………………………………107 圖3-32 以HPAE-PAD 分析中性糖及糖胺……………………………108 圖3-33 以HPAE-PAD 分析解離自乾品燕窩（BN.6）之中性糖及糖胺109 圖3-34 以HPAE-PAD 分析解離自冰糖燕窩（S.12）之中性糖及糖胺110 圖3-35 以HPAE-PAD 分析解離自乾品燕窩（BN.1）之唾液酸……111 圖3-36 以HPAE-PAD 分析解離自冰糖燕窩燕窩（S.11）之唾液酸112 圖 3-37冰糖燕窩產品之唾液酸含量比較 …………………………113 圖 3-38 (A)以HPAE-PAD 分析解離自冰糖燕窩（S.12）之中性糖及糖胺 (B)75%酒精處理 ………………………………………………114 圖 4-1燕窩分析流程圖 ……………………………………………115en-US燕窩thesis