余榮熾臺灣大學：生化科學研究所謝爵徽Hsieh, Chieh-HuiChieh-HuiHsieh2007-11-262018-07-062007-11-262018-07-062004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/52778人類I基因有三種isoforms，分別命名為IGnTA、IGnTB和IGnTC。這三種isoforms有相同的exon 2與exon 3，但卻有不同的exon 1 (1A、1B和1C)。它們的表現量在不同的組織或細胞中不盡相同，例如IGnTC僅表現在紅血球細胞，而IGnTB僅表現在水晶體上皮細胞，且每一個不同exon 1上游由不同的promoters所主導。在這次研究中，我們發現I基因A型(IGnTA)上游有兩段可能的調控區，一段在-75/+151區域，另一段在-2148/-1917區域。在+75/-151區域中有一段可能的GATA-1結合序列TGATAG，而在-2148/-1917區域中則有一段可能的NF-E2 / AP-1結合序列CTGAGTCA，而且在-2148/-1917區域中調控轉錄的序列很可能是一enhancer。Human IGnT gene (I gene) have three isoforms designated IGnTA, IGnTB, and IGnTC , which contain different exon 1(1A,1B,and 1C) but share the common exon 2 and exon 3. The expression patterns of the three isoforms are tissue- or cell-specific. For example, IGnTC is the only one expressed in reticulocytes, whereas only the IGnTB is expressed in lens-epithelium cells. It is believed that the different exon 1 of I gene are preceded with distinct promoters. In this study, we found that there are two positive regulatory elements, one in the region –75/+151 and another in –2148/-1917, upstream of IGnTA gene. There is a potential GATA-1 binding site (TGATAG) in the region –75/+151 and a potential NF-E2/AP-1 binding site (CTGAGTCA) in the region –2148/-1917. In addition, the positive regulatory element located in the region –2148/-1917 might be an enhancer.縮寫表 ………………………………………………………………… 1 摘要 …………………………………………………………………… 2 Abstract ……………………………………………………………… 3 前言 …………………………………………………………………… 4 1.Ii抗原的發現 ……………………………………………………… 4 2.Ii抗原的生合成 …………………………………………………… 5 3.成人i血型與先天性白內障 …………………………………………7 4.人類I醣抗原轉化酶基因座 …………………………………………8 5.不同promoters調控isoforms的表現 …………………………… 10 6.研究構想 ……………………………………………………………12 實驗方法 ………………………………………………………………13 1.聚合酶連鎖反應(PCR, polymerase chain reaction) …………13 2.轉型(Transformation) ……………………………………………18 3.微量質體製備(Plasmid minipreparation) …………………… 20 4.限制酶切位反應(Restriction enzyme digestion) ……………20 5.DNA純化(DNA purification) …………………………………… 20 6.報導載體建構(Reporter vector construction) ………………22 7.報導載體大量製備 …………………………………………………25 8.DNA定序 …………………………………………………………… 25 9.細胞培養(Cell culture) …………………………………………25 10.轉殖(Transfection) …………………………………………… 26 11.細胞的藥物處理 ………………………………………………… 27 12.Luciferase 分析 …………………………………………………27 13.搜尋轉錄因子結合位置 ………………………………………… 28 結果 ……………………………………………………………………29 1.人類I基因不同exon 1 (1A、1B和1C)上游片段轉錄活性比較 …29 2.以mitogens處理K562細胞對人類I基因exon 1上游片段轉錄活性的 影響 …………………………………………………………………29 3.人類I基因exon 1A上游不同長度片段之轉錄活性 ………………34 4.可能的轉錄調控區與轉錄因子結合位置 …………………………36 5.Enhancer所存在的位置 ……………………………………………38 討論 ……………………………………………………………………43 參考文獻 ………………………………………………………………46en-USI基因IGnT geneother