指導教授：黃慶璨臺灣大學：生化科技學系謝宛伶Hsieh, Wan-LingWan-LingHsieh2014-11-262018-07-062014-11-262018-07-062014http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/261606自小孢子靈芝 (Ganoderma microsporum) 分離出之真菌免疫調節蛋白質 (Fungal immunomodulatory protein) GMI 已證實能藉由與細胞膜表面受器作用，活化下游訊息傳遞路徑，進而具有調節細胞免疫反應 (Cell immune) 或抗腫瘤 (Anti-tumor) 等功效。本研究探討位於 GMI 部分片段 (Partial fragments) 之生理活性。藉由二級結構的比對及生物資訊軟體的分析，篩選出一個 α-helix 片段及三個 β-sheet 短胜肽 (Peptides) 片段進行化學合成，生產高純度及高產量之短胜肽。據細胞免疫活性測試結果顯示野生型蛋白質 GMI 及突變型蛋白質 GMI-L6C 皆能有效促進人類淋巴癌 T 細胞株 Jurkat 分泌 IL-2，而 α-helix 短胜肽 (GMIαL6C) 及三個 β-sheet 短胜肽 (GMIβ1531、GMIβ4567 及 GMIβ85103) 則無法促使 Jurkat 分泌 IL-2。在抗腫瘤活性測試中，GMI 及 GMI-L6C 皆能降低人類肺癌細胞株 A549 的存活率及移動能力，雙體的 α-helix 短胜肽 (GMIαL6C) 具抑制 A549 存活率及移動效果，而三個 β-sheet 短胜肽 (GMIβ1531、GMIβ4567 及 GMIβ85103) 則不具影響 A549 存活率及移動的能力。藉由細胞免疫及抗腫瘤試驗結果，GMI-L6C 相較於 GMI 可提升蛋白質免疫調節及抗腫瘤能力，證實穩定雙體構形與其生理活性的必要性；α-helix 短胜肽具抗腫瘤效果，顯示 α-helix 於 GMI 抗腫瘤活性的重要性；而三個 β-sheet 短胜肽則不具生理活性。GMI, a fungal immunomodulatory protein (FIP) isolated from Ganoderma microsporum had been reported that it could interact with cell surface receptors and trigger downstream signal transduction. According to these evidences, FIPs exhibit potent immunomodulation and anti-tumor effect. In this study, we investigated the partial fragments within GMI and analyzed their bioactivities. By analyzing the secondary structure alignment and bioinformatics data, selected one α-helix and three β-sheet amino acid sequences. In order to get high quality and output target peptides, these peptides were produced by chemical synthesis. In terms of cell immune assay, wild type protein GMI and mutative protein GMI-L6C could enhance Jurkat T cells to secret IL-2 but α-helix-peptide and three β-sheet-peptides could not. By analyzing the results of anti-tumor tests, GMI and GMI-L6C could inhibit A549 viability and migration. Interestingly, α-helix-peptide could affect A549 viability and migration. However, three β-sheet-peptides could not inhibit A549 neither viability nor migration. Based on cell immune and anti-tumor assays, GMI-L6C exhibited better immunomodulatory and anti-tumor ability. It’s indicated dimerization is important to its bioactivity. By α-helix-peptide exhibiting anti-tumor activity, it suggested the importance of α-helix in anti-tumor activity of GMI. On the contrary, β-sheet-peptides didn’t have immunomodulatory and anti-tumor activity.摘要 I Abstract II 目錄 III 圖目錄 VI 表目錄 VIII 第一章 前言 1 一、靈芝 1 二、真菌免疫調節蛋白質 2 1. LZ-8 3 2. FIP-gts 3 3. FIP-fve 4 4. FIP-vvo 5 5. FIP-gja 5 6. GMI 5 7. GFO-1、GFO-2 6 三、免疫系統 7 四、癌症治療 8 五、小胜肽藥物 9 六、生物資訊運用 10 七、異源表現系統 11 1. 原核表達系統 11 2. 真核表達系統 11 八、研究動機與目的 13 第二章 材料與方法 30 一、細菌與真菌實驗 30 1. 培養基與藥品 30 2. 菌株與培養條件 31 3. 質體與轉形株 32 二、 蛋白質表現及分析 34 1. P. pastoris 異源蛋白質表現 34 2. P. pastoris 異源蛋白質濃縮與純化 34 3. 蛋白質定量 35 4. 蛋白質聚丙烯醯胺膠體電泳 (SDS-PAGE) 36 5. 西方墨點法 (Western blot) 37 三、生物資訊軟體分析 38 四、 胜肽合成 39 五、奈米微粒分析儀 40 六、細胞實驗 41 1. 細胞培養 41 2. 細胞免疫活性測試 43 3. 抗腫瘤活性測試 45 七、統計分析 46 第三章 實驗結果 47 一、重組蛋白質表現與純化 47 1. 以搖瓶培養生產重組蛋白質 47 2. 蛋白質濃縮與純化 47 3. 蛋白質電泳分析 47 4. 西方墨點法確認蛋白質表現 48 二、篩選目標胜肽合成 51 三、蛋白質及胜肽粒徑大小分析 59 四、細胞免疫活性測試 63 1. 蛋白質及胜肽樣品刺激人類淋巴癌 T 細胞株 Jurkat 63 2. 蛋白質樣品 IL-2 ELISA 結果分析 63 3. 胜肽樣品 IL-2 ELISA 結果分析 63 五、抗腫瘤活性測試 68 1. 分析蛋白質及胜肽樣品抑制人類肺癌細胞株 A549 存活能力 68 2. 分析蛋白質及胜肽樣品抑制人類肺癌細胞株 A549 移動能力 69 第四章 討論 84 一、篩選目標胜肽合成 84 1. α-helix 序列篩選 84 2. β-sheet 序列篩選 85 二、蛋白質及胜肽粒徑大小分析 86 1. 蛋白質樣品單/雙體分析 86 2. 胜肽樣品單/雙體分析 87 三、細胞免疫活性測試 88 1. 蛋白質樣品刺激人類淋巴癌 T 細胞株 Jurkat 88 2. 胜肽樣品刺激人類淋巴癌 T 細胞株 Jurkat 88 四、抗腫瘤活性測試 90 1. 人類肺癌細胞株 A549 存活率分析 90 2. 人類肺癌細胞株 A549 移動能力分析 91 第五章 結論 93 第六章 未來展望 95 第七章 參考文獻 977678862 bytesapplication/pdf論文公開時間：2019/08/22論文使用權限：同意有償授權(權利金給回饋學校)真菌免疫調節蛋白質GMI胜肽α-helixβ-sheet細胞免疫抗腫瘤thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/261606/1/ntu-103-R01b22035-1.pdf