蔡珊珊臺灣大學：植物科學研究所陳泰晏Chen, Tai-YenTai-YenChen2007-11-272018-07-062007-11-272018-07-062006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/57939本研究中從綠島朝日溫泉以及柚子湖地熱區域，分離篩選出六菌株，分別為NTU-445、NTU-1311、NTU-1438、NTU-1645、NTU-1689以及NTU-1701，經過初步之16S rDNA序列比對，可將這些菌株歸屬於 Marinobacter 以及 Hydrogenophilus 兩屬。第一群為NTU-1645、NTU-1689以及NTU-1701，與 Marinobacter lutaoensis BCRC 17087T 之16S rDNA相似度介於96.5 % ~ 97.2 % 之間，最適生長溫度為50 oC，為皆具單鞭毛，不產生孢子之革蘭氏陰性桿菌，經由外觀形態、生理特性以及遺傳特性等相關實驗，可發現分離菌株與 M. lutaoensis BCRC 17087T 除了16S rDNA序列之外，還有若干之差異性，包括了分離菌株可耐受之鹽度 (NaCl) 可高達15 %，且移動性較明顯，另外Citrate、D-cellulobiose、D-galactose、D-mannose、D-melibiose、D-raffinose、D-sobiotol、D-trehalose、D-xylose、glycerol、maltose 、myo-inostiol、L-arginine、L-ornithine、L-valine、Sodium Benzoate、n-butanol等等碳源之利用也有著明顯之差異，而脂肪酸之組成也有所差異，再加上DNA-DNA 雜合反應結果顯示，分離菌株與標準菌株之相似度皆小於 70 %，因此初步判定分離菌株NTU-1645、NTU-1689以及NTU-1701為 Marinobacter屬之新種菌株。 第二群則包括了NTU-445、NTU-1311以及NTU-1438，與Hydrogenophilus thermoluteolus NBRC 14978T 之16S rDNA序列相似度介於96.6 ~ 97.3 % 之間，最適生長溫度為50 oC，為具單鞭毛，不產生孢子之革蘭氏陰性桿菌，經過相關測試，發現分離菌株與不耐鹽的H. thermoluteolus NBRC 14978T 有明顯的差異，分離菌株具有鞭毛，且菌落呈現棕色，可於5 % 之NaCl以及pH 9之條件下生長，此外分離菌株有明顯之解脂酶活 (Lipase) 活性，另外D-fructose、D-galactose、D-melibiose、L-ramnose、L-proline、L-arginine及L-Alanine等碳源利用也有著顯著差異，且分離菌株也多了Alkaline phosphatase、Acid phosphatase、Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase等酵素活性，而脂肪酸之組成也有所差異，且對於抗生素 Streptomycin 之抗性亦有所差異，加上DNA-DNA 雜合反應結果顯示，分離菌株與標準菌株之相似度皆小於 70 %，依照以上之實驗結果可初步判定，分離菌株NTU-445、NTU-1311以及NTU-1438為 Hydrogenophilus屬之新種菌株。In this study, six strains of thermophilic halotolerant bacteria were isolated from geothermal areas in Lutao, Taiwan. They were NTU-445, NTU-1311, NTU-1438, NTU-1645, NTU-1689 and NTU-1701. After amplifying and sequencing the 16S rDNA of those strains , the sequences were compared on NCBI database. According to the 16S rDNA sequences, it is found that the strains might be classified into two groups : Genus Marinobacter and Genus Hydrogenophilus. Group I including isolated strains NTU-1645, NTU-1689 and NTU-1701, showed 96.5 % ~ 97.2 % 16S rDNA sequences similarity to Marinobacter lutaoensis BCRC 17087T, and 99.5 % ~ 99.7 % to each other. The optimal growth temperature of isolates was 50 oC. They were motile with single polar flagellum, non-spore forming gram-negative rods. The swarming motility of isolated strains is also more obvious than the type strain. The isolated strains could growth in medium containing 15 % NaCl, and utilitze citrate, D-cellulobiose, D-galactose, D-mannose, D-melibiose, D-raffinose, D-sobiotol, D-trehalose, D-xylose, glycerol, maltose, myo-inostiol, L-arginine, L-ornithine, L-valine as well as n-butanol as sole carbon source, while the type strain could not. Base on the DNA-DNA hybridization (lower than 70 %), the divergence in 16S rDNA (higher than 3 %), and some morphological, physiological, biochemical properties. The isolated strains could be considered as new species of Genus Marinobacter. Group II including isolated strains NTU-455, NTU-1311 and NTU-1438 showed 96.6 % ~ 97.3 % 16S rDNA sequences similarity to Hydrogenophilus thermoluteolus NBRC 14978T, and 99.1 % ~ 99.7 % to each other. The optimal growth temperature of strains was 50 oC. They were non-spore forming gram-negative rods. The isolated strains were motile with single polar flagellum, and the colonies of isolated strains were brown color. Those morphological properties were different from type strain. The isolated strains could grow in the medium containing 5 % NaCl and pH 9, and utilize D-fructose, D-galactose, D-melibiose, L-ramnose, L-proline, L-arginine and L-alanine as sole carbon source, but type strain can not. The isolated strains also produced the following enzymes: Alkaline phosphatase, Acid phosphatase and Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, and were Streptomycin-resistant. According to the DNA-DNA hybridization (lower than 70 %), the divergence in 16S rDNA (higher than 3 %), and above results, the isolated strains could be considered as new species of Genus Hydrogenophilus.中文摘要 i Abstract iii 縮寫對照表 v 表目錄 vi 圖目錄 vii 第一章 前言 1 1. 嗜熱性微生物 1 2. 嗜熱菌之應用及價值 2 3. 台灣的地熱環境 4 4. 台灣嗜熱菌之研究 5 5. 嗜熱性proteobacteria 6 6. Marinobacter 菌屬介紹 7 7. Hydrogenophilus 菌屬介紹 8 8. 研究目標 9 第二章 材料與方法 10 一、 材料 10 (一) 菌種 10 (二) 藥品與酵素 10 (三) 培養基 11 (四) 儀器 12 二、方法 13 (一) 樣本採集 13 (二) 嗜熱菌之分離、純化與保存 13 1. 菌種之分離與純化 13 2. 菌種之保存 13 2.1 菌種短期與中期保存 13 2.2 菌種長期保存 14 (三) 菌種鑑定 14 一、菌種形態觀察 14 1.1 菌落形態觀察 14 1.2 革蘭氏染色 14 1.3 穿透式電子顯微鏡觀察 15 1.4 菌株移動能力測試 15 二、菌種生理特性測試 16 2.1 生長溫度範圍測試 16 2.2 酸鹼度生長範圍測試 16 2.3 耐鹽度測試 16 2.4 單一碳源的利用能力 16 2.5 澱粉酶 (Amylase) 活性測試 17 2.6 白明膠酶 (Gelatinase) 活性測試 17 2.7 蛋白酶 (Protease) 活性測試 18 2.8 氧化酶 (Oxidase) 活性測試 18 2.9 觸酶 (Catalase) 活性測試 18 2.10 解脂酶 (Lipase) 活性測試 18 2.11 幾丁酶 (Chitinase) 活性測試 19 2.12 甲殼素水解酶 (Chitosanase) 活性測試 19 2.13 木聚醣酶 (Xylanase) 活性測試 19 2.14 彈力蛋白酶 (Elastase) 活性測試 20 2.15 PHB 水解能力測試 20 2.16 API-ZYM 酵素活性檢測 20 2.17 脂肪酸組成分析 21 2.18 抗生素抗性檢測 21 2.19 特殊碳氫化合物之分解 22 三、菌種遺傳特性分析 22 3.1 16S rDNA序列分析 22 3.2 DNA G+C 含量分析 26 3.3 DNA相似度分析 27 第三章 研究結果 30 一、菌株之篩選、分離與純化 30 二、第一群分離菌株之特性分析 30 1. 16S rDNA 序列分析 30 2. 菌株形態觀察 31 2.1 菌落形態觀察 31 2.2 革蘭氏染色觀察 31 2.3 穿透式電子顯微鏡觀察 (負染法) 31 2.4 移動能力測試 31 3. 菌株生理生化特性及細胞組成之分析 32 3.1 溫度生長範圍測試 32 3.2 酸鹼度生長範圍測試 32 3.3 菌株耐鹽度測試 32 3.4 澱粉酶活性測試 32 3.5 白明膠酶活性測試 33 3.6 蛋白酶活性測試 33 3.7 氧化酶活性測試 33 3.8 觸酶活性測試 33 3.9 解脂酶活性測試 33 3.10 幾丁酶活性測試 34 3.11 甲殼素水解酶活性測試 34 3.12 木聚醣酶活性測試 34 3.13 彈力蛋白酶活性測試 34 3.14 PHB 水解能力測試 34 3.15 單一碳源的利用能力 34 3.16 API-ZYM酵素活性檢測 35 3.17 脂肪酸組成分析 35 3.18 抗生素抗性檢測 36 3.19 特殊碳氫化合物之分解 36 4. 其他遺傳特性分析 36 4.1 DNA G+C 含量分析 36 4.2 DNA-DNA 雜合反應 36 4.3 16S rDNA 序列系統演化之分析 37 三、第二群分離菌株 37 1. 16S rDNA 序列分析 37 2. 菌株形態觀察 37 2.1 菌落形態觀察 37 2.2 革蘭氏染色觀察 38 2.3 穿透式電子顯微鏡觀察 (負染法) 38 2.4 移動能力測試 38 3. 菌株生理生化特性及細胞組成之分析 38 3.1 溫度生長範圍測試 38 3.2 酸鹼度生長範圍測試 39 3.3 菌株耐鹽度測試 39 3.4 澱粉酶活性測試 39 3.5 白明膠酶活性測試 40 3.6 蛋白酶活性測試 40 3.7 氧化酶活性測試 40 3.8 觸酶活性測試 40 3.9 解脂酶活性測試 40 3.10 幾丁酶活性測試 41 3.11 甲殼素水解酶活性測試 41 3.12 木聚醣酶活性測試 41 3.13 彈力蛋白酶活性測試 41 3.14 PHB 水解能力測試 41 3.15 單一碳源的利用能力 42 3.16 API-ZYM酵素活性檢測 42 3.17 脂肪酸組成分析 42 3.18 抗生素抗性檢測 43 4. 其他遺傳特性分析 43 4.1 DNA G+C 含量分析 43 4.2 DNA-DNA 雜合反應 43 4.3 16S rDNA 序列系統演化之分析 44 第四章 討論 45 1. 嗜熱菌之採樣與篩選 45 2. 嗜熱菌之分離 46 3. 台灣本土新穎嗜熱菌之研究鑑定 46 3.1 Marinobacter sp. 47 3.2 Hydrogenophilus sp. 49 4. 總結 52 第五章、參考文獻 53 圖表 66 附錄一、熱穩定性酵素之應用 105 附錄二、10X Castenholz basal salt solution 106 附錄三、菌種鑑定技術及基本流程圖 107 附錄四、API-ZYM 酵素套件呈色對照表 108 附錄五、抗生素抑制環對照表 109 附錄六、DNA 雜合反應之藥品及配方 110 附錄七、分離菌株之 16S rDNA 序列 1121398867 bytesapplication/pdfen-US嗜熱菌綠島thermophilichalotolranthot springslutaomarinobacterhydrogenophilusotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/57939/1/ntu-95-R93b42018-1.pdf