陳昭岑臺灣大學：化學研究所林佑忠Lin, Yu-ChungYu-ChungLin2007-11-262018-07-102007-11-262018-07-102007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/51901蛋白質固定化在中孔洞矽膠材料內，最常見的策略就是物理吸附，但物理吸附有蛋白質溶濾的缺點；而化學吸附則因產生化學鍵，導致蛋白質吸附為不可逆。為了解決上述的問題，因此應用配位基-受體作用、金屬離子配位來開發新的固定化策略，期望達到專一性且可逆的固定化。我們開發了兩種不同型態親和性官能基修飾中孔洞材料應用於蛋白質/酵素固定及催化反應。 首先，我們應用醣配基與醣受體蛋白可以專一辨識結合的特性，開發了一系列醣基修飾中孔洞材料來辨識及純化不同醣受體蛋白。研究中使用牛血清蛋白 (BSA)、甘露糖受體蛋白 (Con A)、甘露糖受體蛋白 (LCA) 與甘露糖配基修飾中孔洞材料作用。從膠體電泳實驗證實醣受體蛋白可以專一性地與甘露糖配基修飾中孔洞材料結合，並且經由甘露糖競爭而釋放醣受體蛋白。同時基質輔助雷射脫附游離法飛行時間質譜，也證實了甘露糖配基修飾中孔洞材料可以應用於純化醣受體蛋白。研究發現，孔洞大小對於醣受體蛋白的固定化含量有影響，顯示了有分子篩的效應。除此之外，我們開發的N-乙醯葡萄糖胺修飾中孔洞材料也對於N-乙醯葡萄糖胺受體蛋白 (WGA) 有很高的結合專一性，可以辨識結合並且經由競爭而釋放醣受體蛋白。 其次，我們利用金屬離子親和管柱層析 (Metal-Chelate Affinity Chromatography，MCAC) 的方法，發展可逆結合的酵素固定化的策略。將三乙酸胺基 (NTA) 修飾在中孔洞矽膠材料內，經過鎳離子螯合後，可以與組胺酸鏈配位結合。因此有組胺酸鏈的酵素可以與其作用而專一性地被固定化在中孔洞矽膠內。從膠體電泳及基質輔助雷射脫附游離法飛行時間質譜，也證實含有組胺酸鏈的酵素，可以專一性地固定化在三乙酸胺基修飾中孔洞矽膠材料內，同時藉由加入競爭配基 (imidazole) 可以將固定化的酵素純化分離。而在酵素活性實驗中，固定化的組胺酸鏈修飾過氧化酶保有其酵素催化反應活性，同時也藉由中孔洞材料保護酵素，增加了過氧化酶的熱穩定性。 我們成功地製備兩種不同型態親和性官能基修飾中孔洞材料應用於蛋白質/酵素固定及催化反應：醣基修飾中孔洞材料，透過配位基-受體作用與目標醣受體蛋白進行可逆的結合，並且純化醣受體蛋白；三乙酸胺基修飾中孔洞矽膠材料，透過金屬離子配位，將含有組胺酸鏈的酵素純化、固定化並且進行催化反應。目錄 i 圖目錄 vi 表目錄 xxi 簡稱用語對照表 xxii 中文摘要 xxiii 第一章 單醣配基修飾中孔洞材料應用於辨識醣受體蛋白 1 1-1 醣類與生物體間的關係 1 1-2多價性 (multivalent) 醣配基與醣受體結合探討 3 1-3-1外源凝集素 (Lectin) 的源由 7 1-3-2外源凝結素的構造及作用機制 10 1-3-3外源凝結素的生物活性及功能 13 1-4-1感測分子的組成與原理 14 1-4-2奈米粒子組成感測分子 16 1-4-3中孔洞矽膠材料的應用: 分子閘門 21 1-4-4中孔洞矽膠材料的應用: 生物分子辨識 25 1-5-1對醣受體蛋白有親合力的中孔洞矽膠材料設計原理 31 1-5-2用於修飾中孔洞矽膠材料的醣分子矽烷設計 35 1-5-3醣配基-香豆素矽烷衍生物的合成策略 36 1-5-4單醣配基-香豆素矽烷衍生物的合成探討 38 1-5-5單醣配基矽烷衍生物的合成策略 46 1-5-6單醣配基 (甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺) 衍生物的合成探討 48 1-5-7中孔洞材料置備及修飾 52 1-5-8中孔洞材料鑑定 56 1-6醣配基修飾中孔洞材料與凝集素結合分析實驗 61 1-6-1甘露糖配基-香豆素修飾中孔洞材料 Film-Man-Coumarin 與凝集 素結合分析 62 1-6-2甘露糖配基修飾中孔洞材料 (Film-Man、SBA-Man) 與凝集素結 合分析 69 1-6-3甘露糖配基修飾中孔洞材料 (Film-NH2-Man) 與凝集素結合分 析 76 1-6-4 內表面修飾甘露糖配基中孔洞材料 (Film-in-Man) 81 1-6-5 甘露糖配基修飾中孔洞材料與Lens culinaris agglutinin (LCA) 結合分析 87 1-6-6 N-乙醯基葡萄糖胺配基修飾中孔洞材料 (Film-GlcNAc、SBA- GlcNAc) 與凝集素結合分析 92 1-6-7 醣配基修飾中孔洞材料與凝集素結合分析結論 98 1-7 開發新的機制固定化酵素 99 1-7-1 ConA模印中孔洞矽膠材料 (ConA-imprinted mesoporous silicas, IMS) 之製備 104 1-7-2 ConA模印中孔洞矽膠材料 (ConA-imprinted mesoporous silicas, IMS) 與ConA及LCA結合分析 108 1-7-3 WGA模印中孔洞矽膠材料 (WGA-imprinted mesoporous silicas, IMS) 之製備 112 1-7-4 WGA模印中孔洞矽膠材料 (WGA-imprinted mesoporous silicas, IMS) 與WGA及GLS II結合分析 115 1-7-4 模印中孔洞矽膠材料結論 118 第二章 三乙酸胺基修飾中孔洞材料應用於固定、純化帶有組胺酸鏈 酵素並用其進行催化反應 119 2-1中孔洞材料在酵素固定化上的應用 119 2-2-1 開發新的酵素固定化方法應用在中孔洞材料 136 2-2-2用於修飾中孔洞矽膠材料的三乙酸基胺矽烷分子(NTA-silane) 35設計及合成策略 139 2-2-3用於修飾中孔洞矽膠材料的三乙酸基胺 (NTA-maleimide) 分子 39設計及合成策略 142 2-2-4 NTA-silane (35) 與NTA-maleimide (39) 合成探討 144 2-2-5中孔洞材料製備及修飾 149 2-2-6中孔洞矽膠材料鑑定 151 2-3-1不同型態中孔洞材料與溶菌酶結合分析實驗 158 2-3-2三乙酸基胺修飾中孔洞材料與Histidine-tagged proteins結合分 析實驗 161 2-3-3表面修飾不同長度的組胺酸鏈過氧化酶 (His-tagged HRP) 鑑定 169 2-3-4三乙酸基胺修飾中孔洞材料與過氧化酶結合並催化實驗 182 2-3-5固定化組胺酸鏈修飾過氧化酶活性單位測定 188 2-4雙酵素與中孔洞材料結合並進行連續催化反應 200 2-4-1組胺酸鏈修飾葡萄糖氧化酶與過氧化酶固定於三乙酸胺基修飾 中孔洞材料進行連續反應活性單位測定 203 2-4-2組胺酸鏈修飾葡萄糖氧化酶與過氧化酶固定於三乙酸胺基修飾 中孔洞材料熱穩定性實驗 208 2-4-3三乙酸基胺修飾中孔洞材料結論 211 2-5多重酵素與中孔洞材料結合並進行連續催化反應 212 2-5-1物理吸附Pyruvate kinase及Hexokinase 於中孔洞材料MCF、 MCF-SH內進行連續催化反應 217 2-5-2化學吸附Pyruvate kinase、Hexokinase及Glucose-6-phospahte dehydrogenase 於中孔洞材料MCF內 221 2-5-3化學吸附Pyruvate kinase單一酵素於中孔洞材料MCF內進行連 續催化反應 224 2-5-4化學吸附Hexokinase單一酵素於中孔洞材料MCF內進行連 續催化反應 227 2-5-5化學吸附Pyruvate kinase與Hexokinase雙酵素於中孔洞材料MCF 內進行連續催化反應 230 2-5-6化學吸附Pyruvate kinase、Hexokinase與Glucosse-6-phosphate dehydrogenase多重酵素於中孔洞材料MCF內進行連續催化反應 237 2-5-7化學吸附Glucose-6-phosphate dehydrogenase單一酵素於中孔洞 材料MCF內進行連續催化反應 240 2-5-8多重酵素與中孔洞材料結合並進行連續催化反應結論 243 實驗部分 244 壹en-US中孔洞矽膠材料mesoporous silica materialsthesis