陳義雄臺灣大學：生化科學研究所顏香玉Yen, Hsiang-YuHsiang-YuYen2007-11-262018-07-062007-11-262018-07-062006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/52712轉麩胺醯胺酶(Transglutaminase, TGase)在鈣離子存在的條件下，可以使蛋白質中的離胺酸(Lys, K)和麩胺酸(Gln, Q)進行交聯，形成Lys和Gln之間的isopeptide bond。小鼠儲精囊內的SVSⅢ蛋白質，由265個胺基酸所組成，其中第108-145胺基酸具有5個QXKS/T的重複片段 (X代表脂肪類胺基酸Val、Leu和Ile)，為轉麩胺醯胺酶交聯作用區。已知Lys緊鄰的氮端的胺基酸為脂肪性，而碳端為親水性，符合文獻對TGase基質Lys的歸納。因此這五個QXKS/T序列與TGase的反應能力就決定於另一個基質Gln。因為每個序列的Gln碳端緊鄰的胺基酸都是脂肪性，緊鄰Gln之氮端胺基酸將為影響其作為基質能力的關鍵。 爲了要研究Gln之氮端胺基酸為親水性或疏水性，對於TGase反應能力的影響，依QXKS/T氮端為親水性(Ser和Thr)或疏水性(Ala和Gly)胺基酸，以基因重組技術將SVSⅢ中之QSQIKSQTQVKS和AQLKSQPGQLKT融合於GST，分別命名為F1和F2。比較F1和F2與TGase反應的能力而知，F1較易被TGase催化交聯。利用基因重組的技術，將QSQIKSQTQVKS聯結於表現載體，再利用建構的載體表現exotoxin第27-278 的胺基酸序列和R19L(P12的突變蛋白，將P12蛋白的第19個胺基酸Arg用Leu取代)，命名爲LEX-R19L。將LEX-(R19L)經TGase交聯後，可以加強R19L的免疫抗原性。這項研究證實了利用酵素法來製備多倍體交聯蛋白質是可行的。Mouse seminal vesicle secretion protein SVSⅢ is a glycoprotein containing 265 amino acid residues, in which residues 108-145 is compound of 5 tandem repeats of an oligopeptide QXK(S/T), where X represents an aliphatic amino acid residue. This region has previously demonstrated as a transglutaminase (TGase)-catalyzed site in the formation of an ε-(γ-glutamyl) lysine bond. This work was conducted to assess the impact of amino acid residue on the NH2 side of Q on the TGase substrate activity of QXK(S/T). We prepared a recombinant polypeptide of GST fused to either QSQIKSQTQVKS (F1) or AQLKSQPGQLKT (F2), and assayed their TGase substrate activity. We found that both F1 and F2 but not GST alone could be cross-linked by TGase. The enzyme cross-linked rate of F1was much faster than that of F2, stronger manifestation of QSQIKSQTQVKS than AQLKSQPGQLKT as a good TGase substrate. Meanwhile, a truncated protein that contains residues 27-278 in the exotoxin from Pseudomonas aeruginosa in which V48 is mutated to E was fused to R19L, a mutated P12 in which R19 of the parent protein is replaced by L. This recombinant protein was tentatively designated as EX-R19L. Another recombinant protein LEX-R19L, was prepared by ligation of QSQIKSQTQVKS to EX-R19L, and it was cross-linked by TGase. Female mice were immunized with EX-(R19L)2, LEX-R19L or the TGase-crosslinked LEX-R19L. Among the three antigens, the last one generated the antisera which contained the highest titer of antibody against R19L.中文摘要 iii 英文摘要 iv 縮寫表 v 第一章 緒 論 1 1.1 生殖學概論 1 1.2 哺乳動物雄性生殖系統 1 1.3 雄性附屬性腺的研究 2 1.4 儲精囊分泌蛋白 3 1.5 交配栓的形成和功能 3 1.6 轉麩胺醯胺酶 4 1.6.1 轉麩胺醯胺酶的功能 4 1.6.2 轉麩胺醯胺酶的分類 4 1.6.3 轉麩胺醯胺酶催化的轉化醯基(acyl-transfer)反應 5 1.6.4 轉麩胺醯胺酶的活性反應區和結構 6 1.6.5 轉麩胺醯胺酶的基質選擇性 7 1.7 蛋白酶抑制因子在生殖生理上的研究 8 1.8 利用P12當作免疫避孕抗原的研究 8 1.9 研究背景和動機 9 第二章 實驗方法與材料 10 2.1 重組質體的製備 10 2.1.1 表現載體的圖譜 10 2.1.2 引子的設計 11 2.2 聚合酶連鎖反應 11 2.3 限制酶反應 (Restriction Enzyme digestion) 12 2.4 回收限制酶反應後的DNA片段 14 2.5 DNA 接合反應 15 2.6 質體轉型 (Transformation) 15 2.7 小量質體抽取 17 2.8 核酸定序 18 2.9 重組蛋白的純化 18 2.9.1 純化GST的重組蛋白 18 2.9.2 純化His-tag的重組蛋白 19 2.10 蛋白質定量 20 2.11 TGase基質的交聯反應 21 2.12 SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳 21 2.13 Coomassie Blue G-250染色 23 2.14 西方墨點法 23 2.15 動物實驗和測定R19L抗體力價 25 第三章 實驗結果 27 3.1 比較QXKS/T序列緊鄰Ｑ的氮端胺基酸對TGase反應性的影響 27 3.2 比較F1和F2被TGase交聯的速率 28 3.3 Linker使exotoxin與R19L的融合蛋白被TGase交聯成高分子聚合物 28 3.4 LEX-R19L交聯物的抗原性 29 圖3-1 比較QXKS/T序列緊鄰Ｑ的氮端胺基酸對TGase反應性的影響 30 圖3-2 證實高分子的聚合物是由TGase的交聯反應所形成 32 圖3-3 比較F1和F2被TGase交聯的速率 34 圖3-4 Exotoxin與R19L的cDNA和胺基酸序列 36 圖3-5 製備EX-(R19L)2和LEX-R19L 38 圖3-6 LEX-R19L交聯物的抗原性 40 第四章　結論與未來展望 42 4.1緊鄰Q的氮端胺基酸為親水性將會加強QXKS/T片段與TGase的反應性 42 4.2 LEX-R19L交聯物會提高R19L的抗原性 42 4.3未來的研究方向 42 References 44670804 bytesapplication/pdfen-US轉麩胺醯胺酶交聯作用區substrate activitytransglutaminasemouse SVSⅢotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/52712/1/ntu-95-R93b46028-1.pdf