謝旭亮Hsieh, Hsu-Liang臺灣大學:植物科學研究所趙俐雅Chao, Li-YaLi-YaChao2010-05-112018-07-062010-05-112018-07-062008U0001-3001200811423700http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/181914光敏素A (phytochrome A, phyA)為阿拉伯芥中遠紅光的接受體，主要接收波長700～750 nm；FIN219 (Far-red light insensitive 219)是屬於GH3-like 基因家族中的一員，會被生長素(auxin)大量誘導表現；FIN219也是遠紅光下游的一個光訊息傳遞者，也參與藍光的訊息傳遞。當大量表現FIN219 使阿拉伯芥變得對遠紅光更敏感(hypersensitive)；FIN219缺失則變得對遠紅光不敏感(hyposensitive)。前人研究以LexA 酵母菌雙雜合系統也顯示FIN219 與phyA 有交互作用，本論文即是探討FIN219與光敏素A 之間的交互作用和調控關係。由共免疫沉澱法發現在黑暗中與遠紅光中，在植物體內FIN219 均能與phyA 有交互作用；上位性基因分析指出FIN219 作用於phyA 的下游，並且FIN219 蛋白質的表現僅在遠紅光phyA 突變株中有明顯下降，並且依phyA 突變程度的高低，FIN219 蛋白質含量也隨之降升；FIN219啟動子接GUS (pFIN219::GUS)轉基因到phyA 突變株或野生型，發現pFIN219::GUS/phyA 中GUS 染色大幅降低至幾乎沒有，顯示FIN219 蛋白質含量的多寡或FIN219表現與否取決於植物在遠紅光下phyA存在量的高低或是否存在。觀察GFP-FIN219*PHYA-F-DsRed 雜交植株的螢光，發現GFP-FIN219 在黑暗及遠紅光照射後，可同時與PHYA 出現在細胞核；此外FIN219 無論是否存在，不影響PHYA 進入細胞核的能力。Light is one of the most important enviroment factors, and plants have evolved complex and sophisticated mechanisms to adjust their development to fit this factor. Phytochrome A (phyA) is one of the most extensively studied photoreceptors. phyA mainly absords far-red light (FR,wavelength 700~750nm) in Arabidopsis. FAR-RED INSENSITIVE 219 (FIN219) belongso a GH3-like gene family in Arabidopsis and can be rapidly induced by auxin. There are two coiled-coil domains in FIN219 located in the N- and C-terminal regions respectively. Previous results from yeast two-hybrid studies revealed that the N- and C-terminal domains of FIN219 can interactith the full length of PHYA. Thus, this thesis will confirm the interaction between FIN219 and PHYA, and investigate their regulatory relationship. Co-immunoprecipitation studies indicate that FIN219 can interact with PHYA in the dark and far-red light. Epistatic analysis reveals that FIN219unctions downstream of the photoreceptor phyA. Western blot results showed that FIN219 protein accumulation is positively regulated by PHYA under darkness and far-red light. FIN219 promoter::GUS activity assay in phyA (pFIN219::GUS/phyA) or wild type (pFIN219::GUS/Col-0) under darkness, white light and far-red light revealed that GUS staining is almostbolished in the phyA mutant compared to that in wild type. In addition subcellular localization studies reveal that GFP-FIN219 can colocalize with PHYA-DsRed under darkness and far-red light but FIN219 is not specifically required for light-regulated nuclear accumulation of phyA.目 錄謝••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••I錄••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••II表目錄••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••Ⅳ文摘要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1bstract••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2景介紹•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3、光敏素的種類••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3、光敏素的組成••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••4、光敏素的磷酸化與訊息傳遞••••••••••••••••••••••••••••••••••••5、光敏素A 的生理反應••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••7、光敏素在細胞中的位置與功能•••••••••••••••••••••••••••••••••7、光敏素訊息下游的重要調控••••••••••••••••••••••••••••••••••••8、FIN219（GH3-11）基因•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11、檢測各phyA 突變株中，FIN219 蛋白質表現量，顯示FIN219 需正常phyA，使FIN219 蛋白質正常表現•••••••••••••••••••••••••11、GUS 染色分析pFIN219-GUS/phyA 和pFIN219-GUS/ Col-0 顯示IN219 需要正常phyA，使FIN219 表現••••••••••••••••••••••••••••11、定位phyA 突變處•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12、fin219 phyA 雙突變植株••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12、利用雷射共軛焦顯微鏡觀察光敏素A 與FIN219 在植物細胞中的置•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14、PHYA-F-DsRed/phyA 雜交GFP-FIN219 (簡稱PHYA-F-DsRed/hyA*GFP-FIN219)和PHYA-F-DsRed/ phyA 雜交 fin219(簡稱HYA-F-DsRed/ phyA* fin219)性狀觀察•••••••••••••••••••••••••••••15、利用共免疫沉澱法證實FIN219 與PHYA 的交互作用•••••••••16、35S::GUS-FIN219/Col-0 和35S::PHYA-DsRed/Col-0 雜交植株 . 17表•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••19論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••38考文獻•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••45驗方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••51、定位phyA 突變處••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••51、double mutant 篩選與性狀觀察•••••••••••••••••••••••••••••••••51、葉綠素與花青素萃取••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••52、上位性基因的分析（epistatic analysis）•••••••••••••••••••••••53、雜交植株的觀察，西方墨點法分析蛋白質表現量•••••••••••••53、共免疫沉澱法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••54、雷射共軛焦顯微鏡觀察GFP-FIN219 和PHYA-DsRed 在植物細胞的位置•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••55、轉殖株之製備與分析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••55錄一••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••56錄二••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••78錄三••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••79錄四••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••80表目錄一 西方墨點法分析發現FIN219表現仰賴正常PHYA的存在•••19二 pFIN219::GUS/phyA與pFIN219::GUS/col 在不同光源下生長四的GUS 染色••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••20三 定位phyA 突變處••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••22四 fin219 phyA雙突變植株性狀••••••••••••••••••••••••••••••••23五 觀察光敏素A與fin219雙突變體(phyA/fin219)在不同光源下下胚外表型••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••24六光敏素A 與fin219雙突變體(phyA/fin219)在不同光源下下胚軸長平均的統計圖•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25七 phyA/fin219 雙突變體花青素的含量••••••••••••••••••••••••26八 phyA/fin219 雙突變株的開花時間••••••••••••••••••••••••••27九 觀察PHYA-F-DsRed/phyA幼苗，其PHYA-F-DsRed 在黑暗和黑轉移至遠紅光後在細胞中的位置••••••••••••••••••••••••••••••28十 觀察GFP-FIN219/Col-0幼苗由黑暗轉移到遠紅光2 小時••••29十一 FIN219 存在與否，不影響PHYA 在細胞中的位置••••••30十二 PHYA-F-DsRed/phyA*GFP-FIN219 和PHYA-F-DsRed/phyA*in219 不同光強度遠紅光生長四天，下胚軸觀察•••••••••••••••••31十三 PHYA-F-DsRed/phyA*GFP-FIN219 和PHYA-F-DsRed/phyA*in219 在不同藍光強度生長四天，下胚軸的觀察•••••••••••••••••32十四 共免疫沉澱法證實FIN219 與PHYA 在植物體內的交互作用••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••33十五 35S::GUS-FIN219/Col-0和35S::PHYA-DsRed/Col-0雜交植株苗的外表型•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34十六 西方墨點法偵測35S::GUS-FIN219/Col-0 和35S::PHYADsRed/ol-0 雜交植株的FIN219表現量•••••••••••••••••••••••••••••36十七 35S::GUS-FIN219/ Col-0和35S::PHYA-DsRed/Col-0雜交植株花時間測量•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••37application/pdf34297176 bytesapplication/pdfen-US光敏素FIN219PHYAhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/181914/1/ntu-97-R94b42006-1.pdf