徐源泰Shyu, Yuan-Tay臺灣大學:園藝學研究所陳增蔚Chen, Tseng-WeiTseng-WeiChen2010-05-052018-06-292010-05-052018-06-292008U0001-1302200810291000http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/180729番石榴 (Psidium guajava L.) 與番荔枝 (Annona squamosa) 為台灣重要的果樹，除一般作鮮食外，尚具有高加工和傳統醫學的利用性。台灣野生芭樂之中，紅心芭樂在民俗醫學上最具價值，常見於台灣原住民部落。但由於紅心芭樂並無大量栽種，年產量不定，常有以其他芭樂摻假的情況發生。本研究利用遺傳分子鑑定技術，蒐集台灣原住民各部落之土芭樂進行遺傳物質分析，以建立摻假之辨識系統，並了解各品種土芭樂在原住民部落分佈之情形。番荔枝果實在台灣因改良品種繁多，以果實之外觀形態作為品種區分的依據有者亦不易區分，本研究以分子標誌技術，建立快速鑑別各品種番荔枝之方法，加速果實品種的改良和優良性狀之篩選。研究第一部份分別針對土芭樂及番荔枝核糖體DNA之18S與ITS1、葉綠體DNA之trnL intron與trnL-trnF IGS等區域進行分析，並以NJ、PA、ML及UPGMA演算法計算各區域之演化樹狀圖。結果發現，以18S rRNA可明確的將各部落之土芭樂依地緣之相近性作區分，在各演算結果均一致；以RAPD方法分析，不但可區分紅、白心芭樂，亦可將經濟品種番石榴與土芭樂作區隔，以及不同海拔與緯度環境之土芭樂作區分。在番荔枝的親緣關係分析方面，葉綠體DNA之trnL-trnF IGS序列分析、演算法計算所得之結果，均印證過去以形態作為分類的基礎，可節省果樹生長的時間，適合作為不同品種番荔枝親緣關係分析之鑑定方法。二部份的研究則是探討兩種果樹之果實軟化相關之聚半乳糖醛酶 (polygalacturonase, PG)、乙烯合成關鍵酵素ACC合成酶 (ACC synthase, acs) 與ACC氧化酶 (ACC oxidase, aco) 等後熟基因。紅心芭樂的PG基因 (P. guajava PG, PgPG) 與鳳梨釋迦的PG基因 (Atemoya PG, AtPG) 部分序列之大小分別為346 與351 bp，所推衍之胺基酸序列分別為115及116個胺基酸；此兩段胺基酸序列與其他物種之PG進行排列分析，PgPG與AtPG含有不完整之open reading frame (ORF) 以及有四個高度保守性區域，含有和前人相同之三個胺基酸Gly-His-Gly (GHG) 與保守之Tyr殘基，為PG催化活性部位，具有endo-PG之活性。紅心芭樂ACC氧化酶基因 (P. guajava ACC oxidase gene, PgACO)之部分序列長度為729 bp，推衍出242 bp個胺基酸，經排列比對、結構分析與ORF預測等，PgACO之胺基酸序列有七個保守性的區域，其中高保守性的七個胺基酸殘基為dioxygenase的Fe (II) ascorbate family；後熟過程PgACO因受到乙烯的誘導而表現。鳳梨釋迦ACC合成酶基因 (Atmoya ACC synthase gene, AtACS) 之部分序列長度為990 bp，推衍出323個胺基酸，根據序列經排列比對、結構預測等結果，具有七個高度保守性區域，序列中八個保守胺基酸與aminotransferase有關，且含有決定ACC synthase活性之TNP domain，故證實本研究之AtACS具備ACC synthase的活性。三部分使用real-time PCR分析兩種果樹後熟基因之表現。紅心芭樂之PgPG受到乙烯的誘導，在後熟第三天PG酵素活性增加，果實軟化速度加快；PgACO 在果實未後熟時有些微的表現，經乙烯誘導第二至四天的表現量最高，此時紅心芭樂果實之顏色由綠轉黃，並持續表現至後熟末期。鳳梨釋迦之AtPG基因的表現與果實軟化速率相關，後熟第二天AtPG有最高表現量，此階段鳳梨釋迦果肉軟化速率最高。而由AtACS的表現得知ACC synthase活性增加，乙烯在整個後熟期間持續生成。本研究所建立之分子遺傳鑑別系統和果實軟化與乙烯合成之關鍵的基因對栽培、採收後和加工的利用上都將有實質更進一步開發和應用潛力。Guava and sugar apple are important fruit trees in Taiwan. Red-flesh guava is mostly distributed in indigenous tribes in Taiwan and has valuable application in traditional medicine. Due to the various varieties of red-flesh guava and adulteration problems in fruit materials, a systematic way for classification using molecular marker is necessary to guarantee materials’ reliability and safety. Same manner in sugar apple, there are numerous cultivars and species due to breeding for fruit improvement, thus, reliable molecular detection method is urged for rapidly screening and maintenance of species quality.n the first part, ribosomal DNA 18S, ITS1 and chloroplast DNA trnL intron and trnL-trnF IGS were used for the identification of guava and sugar apple samples. The results were calculated by algorithm NJ, PA, ML and UPGMA. The results showed similarity in each DNA regions. Analysis of uncultivated guavas’ rDNA 18S marker revealed a correlation with their geographical distribution in tribes. In addition, molecular marker of indigenous guava was found different from commercial cultivars, it also reflect differences on altitude and latitude, and red and white-flesh guava. In term of sugar apple, the results showed that cpDNA trnL-trnF IGS was agreeable to morphological classification and suitable for identifying different species and cultivars sugar apples.n the second part, the ripening gene of red-flesh guava and atemoya were identified and characterized. The partial cell wall degradation related genes, PgPG of guava and AtPG of atemoya, were 346 and 351 bp and the deduced amino acid sequences were 115 and 116 in length, respectively. The PgPG and AtPG deduced amino acid aligned with others have an uncompleted OFR and four highly conserved regions that with catalytic sites Gly-His-Gly (GHG) and Tyr residue. On the other hand, PgACO, a ACC oxidase gene from red-flesh guava was 729 bp with 242 deduced amino acids. The alignment of PgACO showed seven conserved regions. There are 9 conserved amino acid residues belongs to dioxygenase, Fe (II) ascorbate family. The expression of PgACO was induced by ethylene. ACC synthase gene (AtACS) of atemoya was 990 bp with a 323 deduced amino acids. Eight amino acid residues in seven conserved regions were correlated with aminotransferase. TNP domain of conserved region was a key site for activity of ACC synthase.n the third part, the ripening-related gene expression of red-flesh guava and atemoya were studied by real-time PCR. PgPG and PgACO were induced by ethylene and firmness loss rate of fruit increased while PG activity was high. The skin color of Red-flesh guava turned yellow as high transcription level of PgACO was detected during ripening from 2nd day to 4th day. AtPG was correlated with the rate of fruit soften, and AtACS induced ACC synthase for ethylene production during fruit ripening. The established molecular detection system, and identified ripening-related gene of guava and sugar apple would be useful for further application in cultivation, postharvest and processing.目錄謝 i文摘要 ii文摘要 iv錄 vi一章 研究背景與動機 1一節 番石榴植物介紹 1、番石榴之起源與栽培 1、形態與特性 1、番石榴之品種 2、番石榴之營養成分 3、番石榴的好處 4、番石榴的栽培管理 4、番石榴於臺灣經濟產業概況 5二節 番荔枝植物介紹 10、番荔枝之起源與栽培 10、形態與特性 11、番荔枝之品種 11、番荔枝的栽培管理 14、番荔枝於臺灣經濟產業概況 14三節 國內外番石榴相關研究報告之現況 17、緣由 17、初步統計結果 17、深入分析探討 18四節、主要研究目的 23二章 番荔枝與臺灣原住民部落土芭樂之分子多樣性與親緣分析 25一節、前言 25、傳統植物分類法 26、近代常用之分子標誌 26. 同功異構酶(Isozyme) 26. 逢機擴增多型性 27. 限制酵素片段長度多型性 27. 增殖片段長度多型性 27. 簡單序列重複 29. 定性序列擴增區 29、核糖體基因與葉綠體基因之研究 29. 核糖體基因 (Ribosomal DNA, rDNA) 30. 葉綠體基因 (Chloroplast DNA, cpDNA) 31二節、材料與方法 33、實驗材料 33、實驗方法 36. 葉片DNA的萃取 36. DNA濃度測定 36. 聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) 36. 電泳分析 37. 反應引子(Primer) 38. DNA序列定序 41. 序列排序及親緣關係分析 41三節、結果與討論 42、原住民部落土芭樂之親緣關係分析 42. 土芭樂核糖體DNA上18S之序列與親緣關係分析 42. 土芭樂核糖體DNA上ITS1之序列與親緣關係分析 51. 土芭樂葉綠體DNA上trnL之序列與親緣關係分析 60. 以RAPD方法進行土芭樂親緣關係之分析 68、荔枝核之親緣關係分析 76. 番荔枝核糖體DNA上18S區域之親緣分析 76. 番荔枝核糖體DNA上ITS區域之親緣分析 77. 番荔枝葉綠體DNA上trnL-trnF IGS區域之親緣分析 85四節、結論 93三章、紅心芭樂與鳳梨釋迦果實後熟功能性基因之研究 95一節、前言 95二節、前人研究 96、果實之後熟 (Fruit ripening) 96、後熟相關基因之研究 97. 果實軟化相關基因之研究 97. 乙烯與果實後熟 981)乙烯的生合成 982)相關之研究報告 99、基因表現量之測定 100. 定量競爭聚合酶連鎖反應(QC-PCR) 100. 即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time quantitative PCR, QPCR) 101三節、材料與方法 104、樣品採集 104、乙稀(Ethylene)催熟處理 104、果實Total RNA萃取及cDNA之合成 104、DNA濃度測定 104、果實硬度與糖度測試 105、反應引子 105、聚合酶連鎖反應 107、即時定量聚合酶連鎖反應 (Lightcycler定量分析) 107、電泳分析 108、DNA定序 108一、序列排序及親緣關係分析 108四節、結果與討論 109、後熟期間果實外觀之變化 109、後熟期間果實之硬度變化與糖度之測定 109. 紅心芭樂與鳳梨釋迦果實硬度之測定 109. 紅心芭樂與鳳梨釋迦果實糖度之測定 112、果實後熟相關基因之研究 112. 果實細胞壁軟化基因之分析 112. 後熟期間紅心芭樂ACC氧化酶之分析 120. 後熟期間鳳梨釋迦ACC合成酶之分析 126、果實後熟相關基因表現量之測定 132. 後熟期間紅心芭樂PG與ACC oxidase基因之表現量之測定 132. 後熟期間鳳梨釋迦PG與ACC synthase基因之表現量之測定 135五節、結論 137考文獻 139錄 155目錄一、臺灣常見水果營養成份表 7二、2006年各縣市番石榴產量排序表 8三、95年臺灣各水果栽種面積 9四、2006年各縣市番荔枝栽種面積與產量 16五、植物傳統之分類法 28六、臺灣各縣市原住民部落數目 33七、各縣市原住民部落之土芭樂 34八、非原住民地區採集之土芭樂樣品 34九、鳳山熱帶植物試驗所採集之芭樂經濟品種 35十、本研究使用13種不同之番荔枝品種 35十一、PCR反應引子 38十二、十組10-mer之RAPD之逢機擴增引子 39十三、10個原住民部落之土芭樂核糖體DNA 18S序列相似矩陣 45十四、不同原住民部落土芭樂rDNA 18S區域之各分析法分群對照表 50十五、10個原住民部落土芭樂核糖體DNA之ITS1序列相似矩陣 54十六、不同原住民部落土芭樂rDNA ITS1區域之各分析法分群對照表 59十七、10個原住民部落土芭樂葉綠體DNA之trnL intron與trnL-trnF IGS序列相似矩陣 62十八、不同原住民部落土芭樂cpDNA trnL與trnL-trnF IGS區域之各分析法分群對照表 67十九、根據32個番石榴RAPD之DNA多型性片段製成之遺傳相似矩陣表 73二十、不同原住民部落土芭樂各分析法之分群對照表 75二十一、臺灣番荔枝核糖體DNA之18S序列相似矩陣 78二十二、臺灣番荔枝核糖體DNA之ITS1序列相似矩陣 83二十三、臺灣番荔枝葉綠體DNA之trnL-trnF IGS序列相似矩陣 86二十四、番荔枝rDNA與cpDNA各區域分析結果之分群對照表 91二十五、後熟相關酵素基因進行擴增反應之引子 106二十六、紅心芭樂與鳳梨釋迦PG、ACS、ACO基因之專一引子 106二十七、PG基因推衍之胺基酸序列之相似矩陣表 118二十八、ACO基因推演之胺基酸序列之相似矩陣表 124二十九、ACS基因推演之胺基酸序列之相似矩陣表 128目錄一、各品種番石榴果實 6二、2006年各縣市番石榴產量比例圖 8三、2006年各縣市番荔枝產量比例圖 16四、全球相關番石榴研究期刊報告統計圖 21五、國內相關番石榴研究報告統計圖 21六、相關番石榴報告各項類別研究統計圖 22七、真核核糖體DNA結構之組成 40八、葉綠體DNA上trnL intron與trnL-trnF區域之結構圖 40九、以NS1及NS4引子組對各部落土芭樂進行擴增之電泳分析圖 44十、不同部落土芭樂核糖體基因之18S區域，以NJ計算之親緣關係圖 46十一、不同部落土芭樂核糖體基因之18S區域，以PA計算之親緣關係圖 47十二、不同部落土芭樂核糖體基因之18S區域，以ML計算之親緣關係圖 48十三、不同原住民部落土芭樂之核糖體基因之18S區域，以UPGMA計算之親緣關係圖 49十四、以ITS1及ITS2引子組對各部落之土芭樂進行擴增之電泳分析圖 53十五、不同部落土芭樂之核糖體基因之ITS1區域，以NJ計算之親緣關係圖 55十六、不同部落土芭樂之核糖體基因之ITS1區域，以PA計算之親緣關係圖 56十七、不同部落土芭樂之核糖體基因之ITS1區域，以ML計算之親緣關係圖 57十八、不同部落土芭樂之核糖體基因之ITS1區域，以UPGMA計算之親緣關係圖 58十九、以B49317及A50272引子組對各部落之土芭樂進行擴增之電泳分析圖 61二十、不同部落土芭樂葉綠體基因之trnL intron與trnL-trnF IGS區域，以NJ計算之親緣關係圖 63二十一、不同部落土芭樂葉綠體基因之trnL intron與trnL-trnF IGS區域，以PA計算之親緣關係圖 64二十二、不同部落土芭樂葉綠體基因之trnL intron與trnL-trnF IGS區域，以ML計算之親緣關係圖 65二十三、不同部落土芭樂葉綠體基因之trnL intron與trnL-trnF IGS區域，以UPGMA計算之親緣關係圖 66二十四、土芭樂及經濟品種芭樂進行逢機引子擴增反應之電泳圖 72二十五、20個不同原住民部落與12個經濟品種番石榴之RAPD分析結果，經UPGMA方法進行演算之樹狀圖 74二十六、番荔枝核糖體基因之18S區域，以NJ計算之親緣關係圖 79二十七、番荔枝核糖體基因之18S區域，以PA計算之親緣關係圖 80二十八、番荔枝葉綠體基因18S區域，以ML計算之親緣關係圖 81二十九、番荔枝葉綠體基因18S區域，以UPGMA計算之親緣關係圖 82三十、番荔枝葉綠體基因ITS1區域，以PA計算之親緣關係圖 84三十一、番荔枝葉綠體基因trnL-trnF IGS區域，以NJ計算之親緣關係圖 87三十二、番荔枝葉綠體基因trnL-trnF IGS區域，以PA計算之親緣關係圖 88三十三、番荔枝葉綠體基因trnL-trnF IGS區域，以ML計算之親緣關係圖 89三十四、番荔枝葉綠體基因trnL-trnF IGS區域，以UPGMA計算親緣關係圖 90三十五、定量競爭聚合酶鏈反應 (QC-PCR) 之原理 102三十六、即時定量聚合酶連鎖反應 SYBR Green I 螢光偵測系統示意圖 103三十七、紅心芭樂與鳳梨釋迦在後熟期間果實外觀顏色之變化 110三十八、紅心芭樂與鳳梨釋迦果實後熟期間果肉硬度之變化 111三十九、紅心芭樂與鳳梨釋迦果實後熟期間糖度之變化 113四十、紅心芭樂與鳳梨釋迦後熟相關基因電泳分析圖 116四十一、紅心芭樂與鳳梨釋迦之PG胺基酸與其他物種之PG序列排列圖示 117四十二、紅心芭樂與鳳梨釋迦之PG與其他物種之PGs之樹狀圖 119四十三、紅心芭樂之ACO胺基酸序列與其他物種之ACO胺基酸之排列圖示 121四十四、紅心芭樂ACO胺基酸序列與其他物種ACO胺基酸序列之樹狀圖 125四十五、推衍之ACC synthase胺基酸序列之排列圖示 129四十六、鳳梨釋迦ACC synthase與其他物種之樹狀圖 131四十七、後熟期間紅心芭樂後熟相關基因PgPG與PgACO表現量之測定 134四十八、後熟期間鳳梨釋迦後熟相關基因AtPG與AtACO表現量之測定 136錄一、以紅心芭樂total RNA合成之cDNA經系列稀釋建立即時聚合酶連鎖反應回歸曲線 155錄二、後熟期間鳳梨釋迦AtPG基因表現量測定裂解溫度之曲線 156application/pdf7783400 bytesapplication/pdfen-US番石榴番荔枝後熟分子標誌聚半乳糖醛酶乙烯合成酶guavasugar appleRAPDpolygalacturonaseACC synthaseACC oxidasethesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/180729/1/ntu-97-D92628008-1.pdf