林聖賢臺灣大學:化學研究所梁嘉岑Liang, Chia-TsenChia-TsenLiang2010-06-302018-07-102010-06-302018-07-102008U0001-1007200821592100http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/187459蛋白質結構與其功能的完整性息息相關，不正常的折疊會造成蛋白質失去其功能並且處於較不穩定的狀態，一些疾病如阿茲海默症與帕金森氏症等等，就是導因於蛋白質的折疊錯誤，了解蛋白質摺疊-展開的機制，將使我們對這些疾病的形成有進一步地了解，甚至發現預防或治療此種疾病的方法。在本研究中，我們企圖用本實驗室所提出的Ising model來描述蛋白質展開的行為，在我們的模型裡，我們將蛋白質視為由單元σi(unit)所組成，單元可以是肽鍵、胺基酸、摺疊子或任何蛋白質摺疊的單位，每個單元只有兩個狀態：自然折疊狀態σi=1或展開狀態σi=-1，數個單元組成一個蛋白質。在實驗上，我們選用細胞色素C當做研究對象，藉由改變尿素濃度或提高溫度，讓細胞色素C逐漸展開，並利用吸收光譜、螢光光譜還有旋光光譜對細胞色素C做偵測，藉以得知細胞色素C展開時局部結構的變化，我們發現Ising model成功地擬合了我們的實驗數據，我們發現這三種光譜所偵測到的過渡曲線皆為一個標準的兩態過渡曲線，故我們將這三種光譜所測到的局部位置各視為一個單元，我們稱之為α-螺旋局部位置(α-helix local site)、色氨酸-59局部位置(Trp-59 local site)，原血紅素局部位置(heme local site)，我們發現這三個局部位置的熱力學穩定度由高至低排列是α-螺旋局部位置、色胺酸-59局部位置，原血紅素局部位置，與傳統的兩態模型不同的是：藉由Ising model的擬合，我們不僅得知其局部位置的熱力學穩定度而且還得知其局部位置與其他單元的作用力 J。藉由比較小角度散射的實驗，我們得知細胞色素C在展開時整個構型的改變，和光譜偵測的結果比較下，我們發現原血紅素局部位置展開對細胞色素C的構型影響不大，其展開的構型改變主要來自於α-螺旋局部位置和色胺酸-59局部位置展開的貢獻。The function of protein is dependent of its folding process. For studying thermodynamic properties of folding-unfolding of protein, cytochrome c is chosen to be the model. Equilibrium unfolding behaviors of cytochrome c induced by presence of urea or changes in temperature are examined via spectroscopic techniques, including absorption、fluorescence and circular dichroism spectrometer. The local structure change can be detected by these spectrometers. The experimental data are fitted by the modified Ising model successfully, and some thermodynamic parameters of the unfolding of cytochrome c are derived, for example, the denature free energy of the local site. Results indicate that the thermodynamic stability of three local sites in cytochrome c ,from stable to unstable, are α-helix local site、Trp-59 local site and heme local site. By comparing with the data of small angle X-ray scattering, we find that native cytochrome c is close to a globular envelope. The envelope elongates gradually to an ellipsoidal shape at high urea concentration (9M) and high temperature (338K). We find the unfolding of heme local site just influences the global volume a little bit. But with the unfolding of α-helix local site and Trp-59 local site, the semi-major axis of cytochrome c elongates dramatically, whereas the semi-minor axis stays roughly the same.口試委員會審定書 i謝 ii文摘要 iii文摘要 iv一章、介紹 1二章、樣品準備與實驗方法 13-1. 偵測原理 13-1-1. 吸收光譜對細胞色素C的偵測 13-1-2. 螢光光譜對細胞色素C的偵測 15-1-3. 旋光光譜對細胞色素C的偵測 17-2. 樣品準備 18-2-1. 偵測色素蛋白C溫度效應的樣品準備 18-2-1-1. 吸收光譜的樣品準備 18-2-1-2. 旋光光譜的樣品準備 19-2-2. 偵測色素蛋白C變性劑效應的樣品準備 19-3. 偵測色素蛋白C展開的實驗方法 20-3-1. 溫度效應的偵測 20-3-1-1. 吸收光譜偵測蛋白質展開溫度效應 20-3-1-2. 旋光光譜偵測蛋白質展開溫度效應 20 2-3-2. 變性劑效應的偵測 21-4. 數據處理 21 2-4-1. 對變性劑效應實驗數據的處理 21-4-2.溫度效應實驗數據的處理 22 2-5. 升溫容槽的設計 24三章、描述蛋白質展開的模型 26 3-1.兩態模型描述蛋白質展開行為 26-2. Ising model描述蛋白質展開的原理 34 3-3. Regular protein描述蛋白質展開的原理 41四章、結果與討論 44-1. 變性劑效應結果與討論 44-2. 溫度效應結果與討論 53五章、結論 60六章、參考文獻 61七章、附錄 65 7-1. 附錄二. 螢光共振能量轉移的原理簡介 65-2. 附錄三.誘導偶極矩的簡介 671597626 bytesapplication/pdfen-US細胞色素C蛋白質展開模型吸收光譜螢光光譜旋光光譜小角度散射Cytochrome cTwo state modelIsing modelAbsorption spectrumFluorescence spectrumCircular dichroism spectrumSmall angle X-ray scatteringthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/187459/1/ntu-97-R95223047-1.pdf