許 輔臺灣大學:園藝學研究所楊政哲Yang, Jeng-JeJeng-JeYang2010-05-052018-06-292010-05-052018-06-292008U0001-2307200822155300http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/180858靈芝 (Ganoderma lucidum (Fr.) Karst) 已知的功效成分包含多醣與免疫調節蛋白 LZ8，但是此兩者調節免疫之對象與機制之差異仍不清楚。本研究第一部份即為探討靈芝多醣PSG與蛋白LZ8對於小鼠腹腔巨噬細胞及脾細胞的活化作用，並檢視兩者對於調節細胞免疫功能之差異；第二部份則建立LZ8酵素連結免疫分析之定量平台，同時定量市售樣品中靈芝蛋白LZ8的含量，以及比較樣品中活性成分多寡與小鼠脾細胞活化作用之相關性。 第一部份結果發現，靈芝多醣PSG可活化小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-alpha，但靈芝蛋白LZ8則是活化腹腔巨噬細胞分泌IL-12，顯示PSG與LZ8活化巨噬細胞分泌不同的細胞激素。另外，LZ8能直接活化小鼠脾細胞與 CD4+ T細胞產生IFN-gamma 與IL-2，同時提高 Th1 相關之細胞激素 mRNA 表現量，但PSG只能活化脾細胞分泌IL-2，且對於CD4+ T細胞則無活化的作用。另一方面，以PSG和LZ8分別活化小鼠腹腔巨噬細胞，再將活化後的巨噬細胞與 CD4+ T細胞共同培養，結果發現經過LZ8處理後的腹腔巨噬細胞，能促進CD4+ T細胞分泌IFN-gamma與IL-2，而PSG處理後之腹腔巨噬細胞，只能促進CD4+ T細胞分泌IL-2，且分泌量較少。此外， PSG與LZ8對TLR4缺失小鼠腹腔巨噬細胞共同培養後，PSG無法活化其分泌TNF-alpha，但仍可促進IL-1 beta 與IL-12的分泌，且PSG與TLR4缺失之腹腔巨噬細胞共同培養後，仍可促進CD4+ T分泌IL-2，故推測其活化的作用來自PSG中所含的微量LZ8。上述結果說明了靈芝蛋白LZ8對於活化T淋巴細胞的效果較顯著。 第二部份利用單株抗體建立 LZ8 之 ELISA 分析方法，其定量曲線(y = 0.0019 x + 0.2973)之線性係數 r2 = 0.9806，定量濃度範圍在0.15 – 200 μg/mL，以此方法來定量四種市售樣品中LZ8含量，其含量介於 0.58 - 11.76 μg/g。此外，分析各市售樣品中LZ8與PSG含量對活化脾細胞之相關性，發現樣品中LZ8含量多寡對於小鼠脾細胞IFN-gamma產生量，具有良好的相關性(r2 = 0.8502)，因此 LZ8 含量與其活化小鼠脾細胞產生IFN-gamma之作用，可作為快速評估靈芝樣品活性成份與規格標準的指標。摘要………………………………………………………………………………………Ibstract…………………………………………………………………………...….…III目錄…………………………………………………………………………………..V表目錄……………………………………………………………………………..VIII、前人研究…………………………………………………………………………….1 一、 靈芝簡介…………………………………………………………………….1 二、 靈芝之免疫調節活性……………………………………………………….2 三、 靈芝多醣……………………………………………….……………………5 四、 靈芝免疫調節蛋白LZ8……………………………………………………10 五、 T淋巴細胞之分化作用……………………………………………………12、 研究動機與目的………………………………………..…………………..13、材料與方法………………………………………………………………………..15 一、靈芝樣本對小鼠巨噬細胞之影響……………………………………………..15 （一） C57BL/6J小鼠腹腔巨噬細胞之取得…………….…………………….15 （二） 細胞激素TNF-alpha之測定………………………………………………….15 （三） 細胞激素IL-12之測定…………………………………………………17 （四） 細胞激素IL-1 beta之測定………………………..…………………………18 （五） 即時定量聚合酶連鎖反應…………………………………….………..19 二、靈芝樣本對小鼠脾臟細胞之影響……………………………………………..21 （一） C57BL/6J小鼠脾臟細胞之取得………………………………….…….21 （二） 小鼠T淋巴細胞之純化……………………………………….………….23 （三） 淋巴細胞增生試驗………………………………………………..……..24 （四） 細胞激素IFN-gamma之測定…………………………………………………..25 （五） 細胞激素IL-2之測定……………………………………………………26 （六） 即時定量之聚合酶連鎖反應…………………………………………….27 （七） 靈芝樣本刺激後之腹腔巨噬細胞與T細胞共同培養………………….30 三、建立 LZ8 的 ELISA 免疫分析平台…………………………………………31 （一） 蛋白質濃度測定…………………………………………………...……..31 （二） 總醣含量測定 (酚-硫酸法Phenol-Sulfuric Acid Method)……...………32 （三） LZ8 抗體生物素化 (biotinylation)…………………………..…………33 （四） LZ8 捕捉及偵測抗體配對之ELISA分析………………..……………34 （五） LZ8 濃度標準曲線建立…………………………………..…………….35 （六） 利用 LZ8 之 ELISA 定量平台分析靈芝樣品……………..…………36amp;#21442;、結果………………………………………………………………………………..38 一、 靈芝多醣proteoglycan與去蛋白靈芝多醣PSG之特性分析………………38 (一) 利用蛋白酵素處理靈芝多醣以得到去蛋白靈芝多醣…………………….38 (二) 靈芝多醣與去蛋白靈芝多醣蛋白含量、總醣含量以及靈芝蛋白LZ8含量分析………………………………………………………………………...39 二、 PSG與LZ8對小鼠腹腔巨噬細胞的影響………………………………….…40 (一) PSG與LZ8分別活化小鼠腹腔巨噬細胞產生不同細胞激素…………….40 三、 PSG與LZ8對小鼠脾細胞的影響…………………………………………….42 (一) LZ8能直接活化小鼠脾細胞與CD4+ T細胞分泌IFN-gamma與IL-2，但PSG無此效果……………………………………………………………………….42 (二) 與LZ8共同培養後能提升CD4+ T細胞之Th1細胞激素 mRNA量的表 現…………………………………………………………………………….44 四、受LZ8活化之腹腔巨噬細胞能活化CD4+ T細胞產生IFN-gamma與IL-2，但PSG無此效果…………………………………………………………………...45 五、靈芝多醣PSG對於TLR4缺失小鼠 (C57BL/10ScN) 之腹腔巨噬細胞與脾細胞仍具活化作用………………………………………………………………….46 (一) PSG無法活化TLR4缺失小鼠之腹腔巨噬細胞產生TNF-alpha，但仍可活化IL-1 beta與IL-12的產生二) PSG與LZ8活化後之腹腔巨噬細胞促進T細胞產生IFN-gamma與IL-2之效果，在正常小鼠與TLR4缺失小鼠中有相同的趨勢……….………………….48 六、建立靈芝免疫調節蛋白之ELISA分析方法……………….………………...49 (一) LZ8捕捉及偵測抗體配對之ELISA分析…………………………………49 (二) LZ8濃度標準曲線建立 …………………………………………………....50 七、建立靈芝產品活性成分的規格標準……………………………………51 (一) 定量市售靈芝健康食品中LZ8 的含量…………………………......51 (二) 產品中活性成分多寡與活化小鼠脾細胞活性的相關性…………..51、討論……………………………………………………………………………….54、結論與未來展望………………………………………………………………….67考文獻……………………………………………………………………………….68application/pdf834085 bytesapplication/pdfen-US靈芝多醣PSG靈芝蛋白LZ8免疫調節免疫分析Polysaccharide of Ganoderma lucidum (PSG)Ganoderma lucidum immunomodulatory protein LZ8ImmunomodulationELISA Immunoassaythesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/180858/1/ntu-97-R95628213-1.pdf