蘇怡寧Su, Yi-Ning臺灣大學:分子醫學研究所盧曉穎Lu, Hsiao-YinHsiao-YinLu2010-05-042018-07-092010-05-042018-07-092009U0001-1708200903490500http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/178729白化症是一種先天性的黑色素生合成異常造成的疾病，由於黑色素的缺乏影響的是全身性的範圍包括全身細胞(皮膚、頭髮以及眼睛)，而造成眼睛皮膚型的白化症(OCA)，倘若色素缺乏只發生在眼睛部份則會造成眼睛型白化症(OA)。典型的白化症患者終其一生都擁有白皙的皮膚、白色的頭髮以及淡顏色的眼睛虹膜，而且也沒有能曬黑的能力，也因為缺乏黑色素容易造成眼睛部份的特殊病變，其中包括視力衰弱以及眼睛震顫等症狀。臨床上眼睛皮膚型白化症可分為四種類型，四種分型都屬於體染色體隱性遺傳模式，國健局公告的疾病發生率約為 1/15,000- / 1/20,000，至少有四種基因(TYR, OCA2, TYRP1以及MATP基因)被證實會造成白化症。但是由於白化症患者臨床表現型的多樣性造成不同類型的白化症臨床表現多有重覆，因此發展與建立白化症基因分析仍有其必然的重要性，以利於提供後續的遺傳諮詢。 本篇論文中收集了來自於36個家庭中的86個樣本數，其中包含了37位白化症患者，同時利用臨床表現紀錄單收集白化症患者的臨床表現，根據臨床的分型診斷來做基因檢測，利用聚合酶連鎖反應(PCR)、高效能液相層吸法(DHPLC)以及自動化定序儀分析來偵測TYR、P以及MATP基因上的點突變，另外使用Gap PCR 以及 Multiplex PCR來偵測P基因上Exon 7的缺失型突變。 結果顯示有24位白化症患者於TYR基因上發現兩個突變點位，有2位患者於TYR基因上發現一個突變點位。而在P基因方面有7位患者有發現兩個突變點位，而有3位患者只在P基因上發現一個突變點位，此外並沒有在MATP基因上發現任何突變點位。因此，本篇論文中的 37位白化症患者於基因分析中有26 (26/37)位在TYR 基因上發現突變，而10 (10/37)位在P基因上發現突變點位，只有一位患者沒有於TYR、P或MATP基因上發現任何突變點位，將此基因分析的結果與臨床表現型做相關性探討。 由於不同的基因發生突變會造成不同類型的白化症，而白化症目前並無治療的方法，因此利用基因分析的結果不但能幫助家族中患有白化者的家庭成員，給予完善的遺傳諮詢及產前診斷，更能藉此研究來建立台灣族群的白化症基因資料庫，了解台灣人常見的白化症類型以及突變好發點位。The term albinism is applied to define a group of inherited abnormalities of melanin synthesis. The reduction in melanin synthesis can be generalized and involve all melanocytes (including skin, hair follicles, eye etc.), resulting in oculocutaneous albinism (OCA). Classical OCA featured white hair, white skin, and blue eyes, and absence of the ability to tan in the lifelong. In clinical, at least four types of OCA had been categorized. All four types of OCA are inherited as autosomal recessive disorders, and the prevalence rate is between 1/15,000- 1/20,000. At least four genes are responsible for the different types of OCA (TYR, OCA2, TYRP1 and MATP). Due to the overlapping of the clinical manifestations between the OCA subtypes, molecular diagnosis will be helpful in this issue and further genetic counseling.n this study, 86 individuals including 37 affected individuals diagnosed as OCA clinically and their family members were tested by molecular genetic analysis. Strategy with coupling denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) and automated sequencing analysis was performed for TYR, P and MATP genes. Both Gap PCR and gene dosage analysis by Multiplex PCR strategies were used to detect the possible rearrangement in P gene. he result revealed 24 patients were identified as a compound heterozygous or homozygous mutation and 2 patients only one mutation was identified in the TYR gene. In the P gene, 7 patients were identified as a compound heterozygous or homozygous mutation and 3 patients only one mutation was identified. No mutation was identified in the MATP gene. However, the total of 37 patients, 26 (26/37) patients had mutation in the TYR gene, 10 (10/37) patients had mutation in the P gene, and only one patient was not identified any pathologic mutation in TYR, P or MATP gene. Due to albinism is an incurable and irreversible disease, the families with increased risk for an affected child may seek for genetic counseling and possible prenatal genetic testing. In this study, we had established a reliable, efficient molecular diagnostic platform and mutation database for patients with OCA in Taiwan. However, further studies are still warrant to elucidate the genotype – phenotype correlation in OCA.總目錄試委員會審定書……………………………………………………………………..ii謝……………………………………………………………………………………..iii中文摘要……………………………………………………………………………..…iv文摘要………………………………………………………………………………. vi一章 緒論…………………………………………………………………………...1.1 白化症之簡介....................................................................................................1.2 疾病分型及臨床表現…………………………………………………………2.2.1 眼睛皮膚型白化症第一型(OCA1)…………………………………..2.2.1.1 酪胺酸酵素陰性之眼睛皮膚白化症(OCA 1A)………………..3.2.1.2 酪胺酸酵素陽性之眼睛皮膚白化症(OCA 1B)………………...3.2.2 眼睛皮膚型白化症第二型(OCA2)…………………………………..4.2.3 眼睛皮膚型白化症第三型(OCA3)…………………………………..5.2.4 眼睛皮膚型白化症第四型(OCA4)…………………………………..6.2.5 眼睛型白化症(OA)…………………………………………………...6.3 白化症的病理機轉……………………………………………………………7.3.1 白化症病因學的演變………………………………………………...7.3.2 黑色素的生合成……………………………………………………...7.3.3 眼睛皮膚型白化症第一型(OCA1)的病理機轉……………………..8.3.4 眼睛皮膚型白化症第三型(OCA3)的病理機轉…………………….9.3.5 眼睛皮膚型白化症第二型(OCA2)與第四型(OCA4)的病理機轉...9.3.6 眼睛型白化症(OA)的病理機轉……………………………………..9.4 白化症之相關基因…………………………………………………………..10.4.1 Tyrosinase 基因(TYR gene)…………………………………………10.4.2 Pink-Eyed Dilution基因(P or OCA2 gene)………………………….11.4.3 Tryosinase-Related Protein 1 基因(TYRP 1 gene)………………….11.4.4 Membrane-Associated Transporter Protein基因(MATP gene)……...11.4.5 Ocular Albinism 基因(OA gene)……………………………………12.5 白化症之診斷方法與臨床運用……………………………………………..12.5.1 聚合酶連鎖反應(PCR)之原理……………………………………..12.5.2 Gap PCR之原理應用……………………………………………….12.5.3 Multiplex PCR與毛細管電泳(CE)之原理.………………………....13.5.4 高效能液相層析儀(DHPLC)之原理………………………………14.6 研究動機…………………………………………………………………….14二章 實驗材料與儀器……………………………………………………………16.1實驗材料與試劑……………………………………………………………..16.1.1 人類基因體DNA…………………………………………………....16.1.2 引子對(Primer)………………………………………………………16.1.3 聚合酶連鎖反應試劑………………………………………………16.1.4 洋菜凝膠電泳所需的試劑………………………………………….16.1.5 DHPLC試劑組………………………………………………………17.1.6 自動化DNA定序試劑組……………………………………………17.2 實驗儀器……………………………………………………………………..17 2.2.1 磁珠分離式核酸萃取系統………………………………………….17 2.2.2 PCR熱循環器……………………………………………………….17 2.2.3 水平式電泳槽……………………………………………………….17 2.2.4 DHPLC分析儀………………………………………………………17.2.5 High-Performance DNA analysis system (HDA)……………………17 .2.6 DNA序列分析儀……………………………………………………17三章 實驗方法……………………………………………………………………18.1萃取DNA……………………………………………………………………18.2聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)………………………..18.3洋菜凝膠電泳(Agarose gel electrophoresis)…………………………………18.4 Gap PCR……………………………………………………………………..19.5 Multiplex PCR 與毛細管電泳(CE)………………………………………….19 3.6自動化定序分析(Automated DNA Sequencing)與結果確認………………..20.7 DNA片段突變分析儀(DHPLC)……………………………………………..20四章 實驗結果…………………………………………………………………….22.1白化症患者臨床表現資料收集……………………………………………..22.2 Tyrosinase基因(TYR gene)之分析結果…………………………………….23.2.1 Point Mutation以聚合酶連鎖反應後定序之基因分析結果…………23.3 Pink-Eyed Dilution基因( P gene)之分析結果……………….….................24.3.1 Point Mutation以聚合酶連鎖反應後定序之基因分析結果…………24.3.2運用Gap PCR 檢測Deletion Type之結果………………………….25.3.3運用Multiplex PCR 與毛細管電泳檢測Deletion Type之結果…….25.4 MATP基因之分析結果……………………………………………………..25.5基因分析結果之總整…………………………………………………………26五章 討論…………………………………………………………………………27.1 臨床表現型收集探討……………………………………………………….27.2 基因分析結果之探討……………………………………………………….27.2.1 Point mutation之分析結果……………………………………………27.2.2 Cryptic mutation之探討………………………………………………28.3白化症基因型與表現型相關性之探討……………………………………..29.4 遺傳諮詢之運用……………………………………………………………31六章 結語………………………………………………………………………..33七章 參考資料……………………………………………………………………34目錄一 黑色素生成生化途徑…………………………………………………………38二 造成白化症的基因於黑色素生合成過程中所在位置……………………….39三 Gap PCR 引子位置圖…………………………………………………………40四 本論文實驗流程圖…………………………………………………………….41五 TYR 基因突變點位圖…………………………………………………………42六 DHPLC與定序之結果圖……………………………………………………..43七 P 基因基因突變點位圖……………………………………………………..44八 Gap PCR於P基因Exon 7 2.7kb缺失型及無缺失型跑膠之預期結果…….45九 Gap PCR於P基因Exon 7 無2.7kb缺失型(240bp片段)之跑膠結果……..46 十 Multiplex PCR與毛細管電泳之結果圖………………………………………47十一 白化症患者基因分型檢測率………………………………………………..48 十二 白化症患者各基因之檢測率………………………………………………...49目錄一 各類型白化症之臨床表現…………………………………………………… 50二 Genes Associated with Non-syndromic OCA………………………………….51三 聚合酶連鎖反應所使用之TYR 基因引子對…………………………………52四 聚合酶連鎖反應所使用之P 基因引子對……………………………………53五 聚合酶連鎖反應所使用之MATP 基因引子對………………………………55六 聚合酶連鎖反應所使用之所需理想反應試劑條件………………………….56七 聚合酶連鎖反應之理想反應條件參數……………………………………….57八 Gap PCR所使用之P 基因引子對……………………………………………58九 Gap PCR所使用之所需理想反應試劑條件…………………………………..59十 Multiplex PCR所使用之引子對……………………………………..………..60十一 Multiplex PCR之所需理想反應試劑條件…………………………………. 61十二 Clinical Criteria for Oculocutaneous Albinism Sheet………………………..62十三 臨床表現型收集之結果……………………………………………………...64十四 白化症患者臨床表現初步分類及其基因型………………………………...69十五 眼睛虹膜顏色為紅色之白化症患者………………………………………72十六 眼睛虹膜顏色為藍色之白化症患者………………………………………...73十七 TYR 基因的突變點位………………………………………………………..74十八 TYR 基因單一核苷酸多型性點位(SNP)……………………………………75十九 P 基因突變點位……………………………………………………………..76二十 P基因單一核苷酸多型性點位(SNP)……………………………………….77二十一 MATP基因單一核苷酸多型性點位(SNP)……………………………….78二十二 OCA 1患者於TYR 基因上發現的突變點位之各發生頻率……………..79二十三 OCA 2患者於P 基因上發現的突變點位之各發生頻率………………..80二十四 臨床診斷與基因分析不一致之個案…………………………………….. 81二十五 Only one pathological mutation can be identified………………………….82二十六 沒有出現眼睛震顫的患者………………………………………………..83application/pdf1293535 bytesapplication/pdfen-US眼睛皮膚型白化症(OCA)TYR基因P基因MATP 基因基因診斷基因檢測遺傳諮詢Oculocutaneous albinism (OCA)TYR geneP geneMATP geneMolecular diagnosisMolecular genetic testingGenetic counselinghttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/178729/1/ntu-98-P96448004-1.pdf