孫璐西臺灣大學：食品科技研究所何雅嵐Ho, Ya-LanYa-LanHo2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56332老化是一種漸進性的退化過程，包含許多分子、細胞、組織及系統方面的改變。關於老化的原因，迄今所提出的學說不勝枚舉，其中較受公認的為自由基老化理論。經由體內各種過程產生之活性氧物質 (ROS) 會造成氧化傷害。當體內之氧化傷害無法修復時，則造成組織器官功能喪失或老化相關疾病之發生。而現代研究指出飲食中補充抗氧化劑可有效減少老化相關疾病發生而達平均壽命延長之效果。本研究室先前研究，以「Aβ 聚集導致 PC-12 細胞死亡之抑制」為模式，發現蓮子心與芝麻粕具有抗阿滋海默症之能力。基於阿滋海默症等神經性退化疾病與老化之發生皆與體內氧化傷害相關，本研究以蓮子心與芝麻粕為材料，探討兩食材之體外抗氧化能力及體內抗老化活性。 實驗方面，首先以水及四種有機溶劑萃取蓮子心與芝麻粕，其萃取方式為沸點下熱水迴流萃取及室溫下以 95% 乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正己烷四種溶劑之攪拌萃取。再以兩種評估方法檢測抗氧化活性，包括清除 DPPH 自由基和 TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)，另外以「線蟲壽命延長」為模式，評估抗老化活性，並以 EUK-8 作為抗老化研究模式之正對照組。結果顯示，兩食材不同溶劑粗萃物中以蓮子心乙醇粗萃物於抗氧化實驗中展現較高之抗氧化力，其清除 DPPH 自由基之 EC50 為 47.32±1.20 μg/mL，TEAC 值為 0.31 mM Trolox equiv.；而 DPPH 試驗之正對照組為 α-tocopherol (EC50 為 8.40±0.13 μg/mL)，TEAC 試驗之正對照組為 ascorbic acid (TEAC值為 1.16 mM Trolox equivalent)。整體而言抗氧化活性以蓮子心乙醇粗萃物最佳，其次為水、丙酮、乙酸乙酯和正己烷粗萃物；而芝麻粕各溶劑粗萃物之抗氧化活性皆不佳。以線蟲壽命延長為模式之抗老化實驗結果顯示，兩食材各溶劑粗萃物中以蓮子心乙醇粗萃物具有最佳延長線蟲壽命之效果。蓮子心乙醇粗萃物 1000 μg/mL 處理下線蟲平均壽命 23.4±5.7 天（較未處理組增加 25.8% (p＜ 0.001) ），最大壽命期 35 天，80% 線蟲死亡時間 28.2 天，其效果與 100 μM (35.5 μg/mL) EUK-8 （平均壽命增加 24.1% (p＜ 0.001)，最大壽命期 35 天，80% 線蟲死亡時間 27.0 天 ）十分接近。 進一步將蓮子心乙醇粗萃物以正己烷、乙醚、乙酸乙酯及水四種溶劑進行分配萃取，其中以水區分層之抗氧化效果最佳。其對於清除 DPPH 自由基之 EC50 為 25.17±0.19 μg/mL，TEAC 值為 0.41 mM Trolox equiv.。四種區分物於抗老化模式實驗中，亦以蓮子心乙醇粗萃物之水區分物效果最佳，100 μg/mL 的水區分物可延長線蟲平均壽命（16.3% (p=0.0036)），最大壽命期增加 17.2%，80% 線蟲死亡時間延後 12.5%，且於較高濃度處理下具有濃度效應。水區分物 100 μg/mL 之效果與正對照組 25 μM (8.9 μg/mL) EUK-8 相近（增加了 16.3% 的壽命期 (p=0.0044)，且延長最長存活時間（增加 13.8%）與 80% 線蟲死亡時間（增加 14.3%）。 本研究結果顯示蓮子心乙醇粗萃物之水區分物具有相當良好的抗氧化能力與延緩老化使線蟲壽命延長之功效，有潛力發展為保健食品。Aging is an inherently complex process that is manifested within an organism at molecular, cellular, organ, and system levels. There are many theories that have been put forward to explain the process of aging, and one mechanism involving free radical damage seems to emerge in a quite consensual manner. Reactive oxygen species (ROS), produced by a variety of processes, can cause extensive oxidative damages, which would be responsible for age-associated loss of functional capacity. Dietary interventions with antioxidants seem to demonstrate some potential benefits on the average life expectancy, probably by reducing the onset of age-related diseases. In the previous study conducted in our laboratory, using “inhibition of aggregated Aβ-induced PC-12 cell death” as the model for Alzheimer’s disease, has shown that embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed and defatted Sesamum indicum L. have good anti-Alzheimer’s disease capacity. Since both aging and neurodegenerative disease such as Alzheimer’s disease are associated with in vivo oxidative damage, we are therefore interested in investigating the in vitro antioxidation and in vivo anti-aging effects of embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed and defatted Sesamum indicum L. The crude extracts from different solvents were prepared by extracting these two raw materials with boiling water and four solvents (95% ethanol, acetone, ethyl acetate and n-hexane) at room temperature. Then the different solvent extracts of embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed and defatted Sesamum indicum L. were tested for two antioxidative assays, including DPPH free radical scavenging effect and Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay. They were also examined for anti-aging activity using the “prolongation of C. elegans lifespan” as the model, and EUK-8 as the positive control. The results of antioxidant assays revealed that the best effects was exhibited by the 95% ethanol extract of the embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed, followed by its water, acetone, ethyl acetate and n-hexane extract. The EC50 value of embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed 95% ethanol extract in scavenging DPPH free radicals was 47.32±1.20 μg/mL, while its TEAC value was 0.31 mM Trolox equivalent. The EC50 of the positive control (α-tocopherol) is 8.40±0.13 μg/mL for DPPH scavenging ability and ascorbic acid for TEAC assay (TEAC value was 1.16 mM Trolox equivalent). Different solvents extracts of the defatted Sesamum indicum L. did not show good antioxidant activity from both antioxidant assays. Results of anti-aging model experiment showed that treatment of worms with embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed 95% ethanol extract had the best effect on extension the lifespan of C. elegans. Treatment of worms with 1000 μg/mL embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed 95% ethanol extract resulted in an increase in mean lifespan of 25.8% (p＜ 0.001) and also extended maximum lifespan (35 days) and 80% death time (28.2 days). The effect was similar to that of 100 μM (35.5 μg/mL) EUK-8 which can increase mean lifespan by 24.1% (p＜0.001) and can also extend maximum lifespan (35 days) and 80% death time (27.0 days). After liquid-liquid partition of the 95% ethanol extract of the embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed with n-hexane, ethyl ether, ethyl acetate and water consecutively, the water fraction showed the best antioxidant activity. The EC50 value of the water fraction in scavenging DPPH free radical was 25.17±0.19 μg/mL, and the result of TEAC assay (0.41 mM Trolox equivalent) was also the highest. Among the four fractions, water fraction of the embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed 95% ethanol extract had the best effect on the lifespan of C. elegans. Treatment of worms with 100 μg/mL water fraction increased their mean (16.3% (p=0.0036)) and maximum (17.2%) lifespan in addition to 80% death time (12.5%). Extension of the lifespan of C. elegans also exhibited dose response was observed. The effect of 100 μg/mL water fraction had similar effect as the 25 μM (8.9 μg/mL) EUK-8 which increased mean lifespan by 16.3% (p=0.0044) and also extended maximum lifespan (13.8%) and 80% death time (14.3%). This study showed that the water fractions of the 95% ethanol extract of the embryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed contained components with antioxidant activity and could also prolong the lifespan of C. elegans. It thus has good potential to be developed as a functional food for anti-aging.目錄 頁次 中文摘要................................... Ⅰ 英文摘要........................ Ⅲ 目錄............................... Ⅵ 表次......................... Ⅸ 圖次........................... Ⅹ 壹、 前言.......................... 1 貳、 文獻整理................................. 2 一、 老化......................................... 2 二、 自由基之老化理論 (Free radical theory) ........ 4 （一）自由基特性與生物體中自由基的種類................ 4 1. 活性氧物質………………………… 5 (1) 超氧陰離子 (Superoxide, O2•－)…………………… 5 (2) 過氧化氫 (Hydrogen peroxide, H2O2)…………………. 6 (3) 羥自由基 (．OH)……………………………………. 6 (4) 單重態氧 (1O2)…………………………………………. 7 2. 活性氮物質………………………………………………… 7 （二）自由基對生物分子的傷害......................... 8 三、 線蟲 (Caenorhabditis elegans) 與老化研究………. 10 （一）秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans, C. elegans).10 （二）線蟲之生命週期……….……………………………. 11 （三）線蟲與氧化壓力………….……………………………. 12 （四）線蟲於研究上之優勢…………………. 13 四、 飲食與老化…………………………………………….. 14 （一）熱量限制 (Calorie Restriction, CR)………………… 14 1. 定義與對老化之影響…...……………………….......... 14 2. CR 之作用機轉…................................. 15 （二）抗氧化劑 (Antioxidant)………..…………………. 16 1. 維生素 E (Vitamin E)….…...…………………………………………….. 16 2. Coenzyme Q (Isoprenylated benzoquinine, Ubiquinone, Co Q)………… 17 3. EUK-8…………...……………………………………………………….. 17 4. 植物性抗氧化物質.……………………………………………………….. 19 (1) Blueberry 萃取物 (Polyphenol extract) ………………………………. 19 (2) Ginko biloba 萃取物 (EGb761) ………………………………………. 19 (3) Resveratrol……………………………………………………..……….. 20 五、 本研究之材料簡介………………………………………………………... 21 （一）芝麻………………………………………………………………………. 21 （二）蓮子心……………………………………………………………………. 26 參、 研究目的與實驗設計……………………………………………………….. 31 一、 研究目的…………………………………………………………………... 31 二、 實驗設計…………………………………………………………………… 32 肆、 材料與方法………………………………………………………………….. 34 一、 實驗材料…………………………………………………………………... 34 （一）黑芝麻……………………………………………………………………. 34 （二）蓮子心……………………………………………………………………. 34 二、 實驗線蟲與菌種……………………………………………………………. 34 三、 化學藥品、溶劑與各種溶液及培養基配方……………………………… 34 （一）化學藥品………………………………………………………………….. 34 （二）溶劑……………………………………………………………………….. 36 （三）線蟲實驗各種溶液及培養基配方………………………………………. 36 1. NGM agar 相關溶液……………………………………………………… 36 2. Escherichia coli OP50 液態培養基………………………………………. 37 3. M9 buffer…………………………………………………………………... 37 四、 儀器設備 ………………………………………………………………….. 37 （一）樣品製備相關儀器設備…………………………………………………… 37 （二）抗氧化能力分析相關儀器設備…………………………………………… 38 （三）線蟲模式實驗相關儀器設備…………………………………………….. 38 五、 實驗方法…………………………………………………………………… 39 （一）樣品製備………………………………………………………………….. 39 1. 樣品前處理………………………………………………………………... 39 2. 水粗萃物之製備………………………………………………………….. 40 3. 其他溶劑粗萃物之製備…………………………………………………... 40 4. 樣品粗萃物之溶劑區分（liquid-liquid partition）物製備………………. 40 （二）萃出率測定……………………………………………………………….. 41 （三）抗氧化能力之評估方法…………………………………………………… 41 1. DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate) 自由基清除能力之測定.. 41 2. TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) 總抗氧化能力之測定…. 42 （四）線蟲之培養與保存………………………………………………………… 43 1. 線蟲之單一寄生物培養 (Monoxenic culture)…………………………… 43 2. 線蟲蟲卵分離…………………………………………………………….. 43 3. 線蟲冷凍………………………………………………………………….. 44 （五）試驗樣品萃出物延長線蟲壽命活性之篩選……………………………. 44 1. 線蟲之無寄生物培養……………………………………………………. 44 2. 一般線蟲壽命計數………………………………………………………. 45 3. 老齡線蟲壽命計數………………………………………………………. 46 六、 統計分析…………………………………………………………………… 46 伍、 結果與討論………………………………………………………………….. 47 一、 不同溶劑蓮子心及芝麻粕粗萃物之萃出率……………………………… 47 二、 樣品粗萃物抗氧化性檢測………………………………………………… 47 （一） DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate) 自由基清除能力之測定 47 1. 蓮子心…………………………………………………………………….. 48 2. 芝麻粕…………………………………………………………………….. 49 （二）總抗氧化力（TEAC）之測定…………………………………………… 50 1. 蓮子心…………………………………………………………………….. 50 2. 芝麻粕…………………………………………………………………….. 52 三、 以「線蟲壽命延長」模式評估樣品粗萃物抗老化功效………………… 52 （一）線蟲壽命延長模式之建立………………………………………………… 52 （二）樣品粗萃物延長線蟲壽命之活性評估…………………………………. 53 1. 蓮子心…………………………………………………………………….. 53 2. 芝麻粕……………………………………………………………………. 55 （三）樣品粗萃物延長老齡線蟲壽命之活性評估……………………………. 56 1. 蓮子心…………………………………………………………………….. 57 2. 芝麻粕…………………………………………………………………….. 57 四、 蓮子心乙醇粗萃物各溶劑區分物之萃出率及其所佔百分比……………. 58 五、 蓮子心乙醇粗萃物各溶劑區分物抗氧化性檢測………………………… 58 （一） DPPH自由基清除能力之測定…………………………………………. 58 （二）總抗氧化力（TEAC）之測定………………………………………….. 59 六、 以「線蟲壽命延長」模式評估蓮子心乙醇粗萃物不同極性區分物抗老化功效………………………………………………………………………. 60 （一）蓮子心乙醇粗萃物不同極性區分物延長線蟲壽命之活性評估……….. 60 （二）蓮子心乙醇粗萃物不同極性區分物延長老齡線蟲壽命之活性評估….. 61 陸、 結論………………………………………………………………………….. 63 柒、 參考文獻…………………………………………………………………….. 97 捌、 附錄……………………………………………………………………………. 107 表次 頁次 表 2-1 芝麻粕之組成份 …………………….……………………………...….. 23 表 2-1 食材萃出物抗 Aβ25-35 細胞毒性之能力…………………………...….. 24 表 5-1 以不同溶劑萃取蓮子心及芝麻粕之萃出率 (%)…………………...…. 64 表 5-2 蓮子心及芝麻粕不同溶劑粗萃物清除 DPPH 自由基之 EC50…...…. 64 表 5-3 蓮子心及芝麻粕不同溶劑粗萃物清除 ABTS+•自由基之 TEAC 值.. 65 表 5-4 不同濃度 Euk-8 對線蟲壽命影響…...……...……...……...……...…… 65 表 5-5 不同濃度蓮子心各溶劑粗萃物對線蟲壽命影響…...……...……...…... 66 表 5-6 不同濃度芝麻粕各溶劑粗萃物對線蟲壽命影響…...……...……...…... 67 表 5-7 不同濃度蓮子心各溶劑粗萃物對老齡線蟲壽命影響…...……...…….. 68 表 5-8 不同濃度芝麻粕各溶劑粗萃物對老齡線蟲壽命影響…...……...…….. 69 表 5-9 蓮子心乙醇粗萃物經不同溶劑區分得各區分層之萃出率及其所佔百分比…...……...……...……...……...……...……...……...……...………. 70 表 5-10 蓮子心乙醇粗萃物之不同溶劑區分物清除 DPPH 自由基之 EC50… 70 表 5-11 蓮子心乙醇粗萃物之不同溶劑區分物對清除 ABTS+•自由基之 TEAC 值…...……...……...……...……...……...……...……...……...… 71 表 5-12 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之不同極性區分物對線蟲壽命影響…… 72 表 5-13 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之不同極性區分物對老齡線蟲壽命影響 73 圖 次 頁次 圖 2-1 1900 至 2000 年美國 65 歲以上 (A) 及 85 歲以上 (B) 老年人口比例；及 (C) 2005年美國各年齡人口分布………………………..….. 3 圖 2-2 ROS 及氧化壓力造成之衰老進程機轉……………………………...….. 9 圖 2-3 線蟲於 22℃ 之生命週期……………………………………….…...…... 11 圖 2-4 Vitamin E 之結構………………………………………………………… 16 圖 2-5 Coenzyme Q10 之結構……………………….…………………………… 17 圖 2-6 A: EUK-8 之結構。B: EUK-8 具有之抗氧化酵素活性…….…………. 18 圖 2-7 Resverstrol 之結構………..……………………………………………… 21 圖 2-8 Sesaminol glucosides 之化學結構………….……………………………. 23 圖 2-9 不同濃度食材水萃出物抗 Aβ25-35 細胞毒性之能力（A）與對 PC-12 細胞存活率之影響（B）…………………………………………………. 25 圖 2-10 蓮子心所含 lotusine 之結構……………………………………….……. 27 圖 2-11 蓮子心所含甲基蓮心鹼 (neferine) 及異蓮心鹼 (isoliensinine) 之結構 27 圖 3-1 本研究之整體架構……………………………………………….…..…… 32 圖 3-2 蓮子心乙醇粗萃物之溶劑區分流程圖………………………….…..…… 33 圖 5-1 DPPH 自由基（1）與 DPPH 還原型（2）之結構…………………… 48 圖 5-2 蓮子心各溶劑粗萃物對 DPPH 自由基清除之效果…………………… 74 圖 5-3 芝麻粕各溶劑粗萃物對 DPPH 自由基清除之效果…………………… 75 圖 5-4-1 蓮子心水和乙醇粗萃物清除 ABTS＋•自由基之濃度效應……………... 76 圖 5-4-2 蓮子心丙酮、乙酸乙酯及正己烷清除 ABTS＋•自由基之濃度效應…… 77 圖 5-4-3 抗壞血酸與 Trolox 清除 ABTS＋•自由基之濃度效應………………… 78 圖 5-4-4 芝麻粕水、乙醇、丙酮及乙酸乙酯粗萃物清除 ABTS＋• 自由基之濃度效應…………………….…..………………………….…..…………… 79 圖 5-5 不同濃度 EUK-8 處理對線蟲生存曲線影響（1）……………………. 80 圖 5-6 不同濃度 EUK-8 處理對線蟲生存曲線影響（2）……………………. 80 圖 5-7 不同濃度蓮子心水粗萃物處理對線蟲生存曲線影響………………….. 81 圖 5-8 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物處理對線蟲生存曲線影響……………….. 81 圖 5-9 不同濃度蓮子心丙酮粗萃物處理對線蟲生存曲線影響……………….. 82 圖 5-10 不同濃度蓮子心乙酸乙酯粗萃物處理對線蟲生存曲線影響………….. 82 圖 5-11 不同濃度蓮子心正己烷粗萃物處理對線蟲生存曲線影響…………….. 83 圖 5-12 不同濃度芝麻粕水粗萃物處理對線蟲生存曲線影響………………….. 83 圖 5-13 不同濃度芝麻粕乙醇粗萃物處理對線蟲生存曲線影響……………….. 84 圖 5-14 不同濃度芝麻粕丙酮粗萃物處理對線蟲生存曲線影響……………….. 84 圖 5-15 不同濃度芝麻粕乙酸乙酯粗萃物處理對線蟲生存曲線影響………….. 85 圖 5-16 不同濃度 EUK-8 處理對老齡線蟲生存曲線影響…………………….. 85 圖 5-17 不同濃度蓮子心水粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響…………….. 86 圖 5-18 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響…………... 86 圖 5-19 不同濃度蓮子心丙酮粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響…………... 87 圖 5-20 不同濃度蓮子心乙酸乙酯粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響……... 87 圖 5-21 不同濃度蓮子心正己烷粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響……….. 88 圖 5-22 不同濃度芝麻粕水粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響…………….. 88 圖 5-23 不同濃度芝麻粕乙醇粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響…………... 89 圖 5-24 不同濃度芝麻粕丙酮粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響…………... 89 圖 5-25 不同濃度芝麻粕乙酸乙酯粗萃物處理對老齡線蟲生存曲線影響…….. 90 圖 5-26 蓮子心乙醇粗萃物之不同溶劑區分物對 DPPH 自由基清除之效果… 90 圖 5-27 蓮子心乙醇粗萃物之正己烷、乙醚、乙酸乙酯及水區分物對清除 ABTS＋•自由基之濃度效應………..………..………..………………….. 91 圖 5-28 不同濃度 EUK-8 處理對線蟲生存曲線影響（3）…………………… 92 圖 5-29 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物處理對線蟲生存曲線影響（2）………… 92 圖 5-30 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之正己烷區分物處理對線蟲生存曲線影響………..………..………..………..………..………..………………….. 93 圖 5-31 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之乙醚區分物處理對線蟲生存曲線影響... 93 圖 5-32 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之乙酸乙酯區分物處理對線蟲生存曲線影響………..………..………..………..………..………..……………….. 94 圖 5-33 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之水區分物處理對線蟲生存曲線影響….. 94 圖 5-34 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之正己烷區分物處理對老齡線蟲生存曲線影響………..………..………..………..………..………..………..…… 95 圖 5-35 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之乙醚區分物處理對老齡線蟲生存曲線影響………..………..………..………..………..………..……………….. 95 圖 5-36 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之乙酸乙酯區分物處理對老齡線蟲生存曲線影響………..………..………..………..………..………..………….. 96 圖 5-37 不同濃度蓮子心乙醇粗萃物之水區分物處理對老齡線蟲生存曲線影響………..………..………..………..………..……….…………………… 96 附圖 1 UV-light 照射時間與 E. coli 存活菌數………………………………… 1077114743 bytesapplication/pdfen-US老化抗氧化活性線蟲芝麻粕蓮子心agingantioxidative activityC. elegansdefatted Sesamum indicum Lembryo of Nelumbo nucifera Gaertn. seed[SDGs]SDG3thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56332/1/ntu-96-R94641030-1.pdf