謝旭亮臺灣大學：植物科學研究所李德政Lee, Te-ChengTe-ChengLee2007-11-272018-07-062007-11-272018-07-062006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/57985在成熟的番茄果實中含有豐富的類胡蘿蔔素，包含：茄紅素(~90%)、β胡蘿蔔素(~5-10%)及葉黃素(~1-5%)，可作為其他維生素之前驅物或抗氧化劑。這些類胡蘿蔔素生合成相關的酵素目前已有相當詳盡之報導，不過在調控方面目前所知不多。另外，番茄屬溫帶作物，對溫度很敏感，溫度太高則類胡蘿蔔素無法正常累積。是否耐熱與非耐熱番茄品系在果實的色素累積上有差異，目前亦無相關報導。在本研究中，我們想要了解耐熱性與非耐熱性的番茄品系在不同光照處理下，茄紅素的累積是否會有差異。並進一步探討，那些受光調控的因子影響茄紅素的累積。 我們以不同耐熱及非耐熱品系綠熟期的番茄果實(CL5915、CL5675、L18及CHT1200)進行試驗，發現與黑暗相比較除了已被證實的紅光之外，藍光亦可增加耐熱番茄品系(CL5915、L18)果實中茄紅素的含量。選擇CL5915超耐熱番茄品系，利用Suppression Subtractive Hybridization (SSH)將藍光處理的番茄果實中表現之基因扣減掉黑暗處理者，確定找到16個基因在藍光及黑暗中具有差異性的表現，其中4個在藍光下的表現量較高，其餘12個在黑暗中具有較高表現量。藉由文獻之搜尋，選擇下列4個可能的候選基因並進行進一步的功能性研究：(1) Lycopersicon esculentum vacuolar proton ATPase proteolipid subunit (LeV-ATPase)；(2) Lycopersicon esculentum TDR4 transcription factor (LeTDR4)；(3)Lycopersicon esculentum phytoene synthase (LePSY)；(4) Lycopersicon esculentum S-adenosyl-l-homocysteine hydrolase (LeSAHH)。利用RT-PCR檢測候選基因的組織專一性表現，發現四個候選基因在紅熟期之果實中表現量皆有增加。另外，LeTDR4、LePSY及LeSAHH可以受到光誘導表現，其中LeTDR4及LePSY在果實中的基因表現量與茄紅素含量成正相關。利用VIGS降低果實中的基因表現，證實LeTDR4、LePSY及LeSAHH確實能夠影響番茄果實中茄紅素的累積。Carotenoids are rich in ripening tomato fruit and made up of lycopenes (~90%), β-carotenes (~5-10%) and luteins (~1-5%), providing nutritional benefits as precursors to essential vitamins and as antioxidants. Although genes involved in carotenoid biosynthesis have been extensively studied, regulatory mechanisms responsible for the process remain largely unknown. Lycopenes are not accumulated under high temperature. Whether lycopene accumulations are different between heat-tolerant and nonheat-tolerant tomatoes remain to be elucidated. Thus, the thesis is intented to understand the differences in lycopene accumulations between heat-tolerant tomato and nonheat-tolerant tomato under various light treatments and also to identify light-regulated factors involved in the control of lycopene levels of tomato fruit. Tomato fruits of different cultivars (CL5915, CL5675, L18 and CHT1200) at mature green stage were treated with different light sources and found that blue light, in addition to red light, can increase lycopene levels, especially in heat-tolerant tomato lines (CL5915、L18). So we chose the super heat tolerant CL5915 line for further studies. Use blue light treated tomato fruit cDNA as tester, dark treated tomato fruit cDNA as driver to perform suppression subtractive hybridization (SSH). Sixteen genes were shown to have differential expression patterns between dark and blue light treated tomato fruits. Four of these 16 genes were expressed in higher levels under blue light and other 12 genes were expressed more in the dark than in the blue light. We chose 4 candidate genes for further functional studies based on literature search : (1) Lycopersicon esculentum vacuolar proton ATPase proteolipid subunit (LeV-ATPase), (2) Lycopersicon esculentum TDR4 transcription factor (LeTDR4), (3) Lycopersicon esculentum phytoene synthase (LePSY), (4) Lycopersicon esculentum S-adenosyl-l-homocysteine hydrolase (LeSAHH). Tissue specific expression studies indicated that all of them were expressed at the red ripe stage of tomato fruit. Besides, the expression of LeTDR4, LePSY and LeSAHH can be induced by light and the expression levels of LeTDR4 and LePSY are positively correlated with lycopene accumulations. Further, using virus-induced gene silencing (VIGS) to knock down the expression of LeTDR4, LePSY and LeSAHH genes in tomato fruits indeed reduced lycopene levels. Taken together, LeTDR4, LePSY and LeSAHH genes isolated by SSH are involved in the regulation of lycopene levels of tomato fruit.目錄 中文摘要 i 英文摘要 ii 第一章 前言 一、背景介紹 (一) 番茄的性質 1 (二) 番茄中主要類胡蘿蔔素之特性及功能 2 (三) 類胡蘿蔔素生合成路徑 3 (四) 類胡蘿蔔素生合成相關酵素在番茄果實成熟過程中所受到之調控 4 (五) 光與番茄果實的色素累積之相關性 5 (六) 溫度對番茄生長及色素含量的影響 7 二、研究策略 (一) 檢測不同品系番茄果實，不同光照處理下茄紅素含量的變化 8 (二) 確認光照處理下，茄紅素增加的番茄果實中具差異性表現之基因 8 (三) 利用北方雜合分析或RT-PCR確認基因是否有差異性表現 9 (四) 選擇候選基因 9 (五) Virus-Induced Gene silencing(VIGS) 9 三、實驗技術原理簡介 (一) SSH 10 (二) VIGS 11 第二章 材料與方法 一、選用的番茄品系及栽種條件 13 二、番茄齡期的標定及光照處理條件 13 三、茄紅素定量 14 四、SSH 15 五、Northern analysis 15 六、RT-PCR 16 七、候選基因的組織專一性表現偵測 16 八、VIGS的質體構築 16 九、番茄植株栽種條件及以膿桿菌為媒介的VIGS感染方法 17 第三章 結果 一、藍光亦可增加部分耐熱性番茄品系果實中茄紅素含量之累積 19 二、利用SSH，得到67 EST clones，代表36個不同基因 20 三、十六個基因在藍光及黑暗中具有差異性表現 20 四、十六個具有差異性表現基因之相關文獻 23 五、候選基因在不同番茄品系果實中，不同光照處理下的表現量 29 六、四個候選基因在不同組織及果實不同時期的表現 30 七、利用VIGS 降低候選基因在果實中的表現量， 對果實在自然光下茄紅素累積之影響 31 八、利用VIGS 降低候選基因在果實中的表現量， 對果實在藍光下茄紅素累積之影響 31 第四章 討論 一、藍光對番茄果實茄紅素累積的影響 33 二、候選基因的選擇 35 三、候選基因在番茄果實中基因表現量與茄紅素含量之探討 36 四、總結 38 五、未來工作建議 39 第五章 圖表 41 第六章 參考文獻 59 附錄一 實驗方法 68 附錄二 一般藥品之配製 82 附錄三 番茄種植及種子收集 831368467 bytesapplication/pdfen-US番茄茄紅素藍光tomatolycopeneblue lightVIGSsuppression subtractive hybridizationotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/57985/1/ntu-95-R93b42023-1.pdf