陳明汝臺灣大學:動物科學技術學研究所陳希嘉Chen, Hsi-ChiaHsi-ChiaChen2010-05-112018-06-292010-05-112018-06-292009U0001-0501200914083800http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/182049本研究嘗試利用聚合酶連鎖反應-變性梯度膠體電泳（PCR-DGGE）與寡核苷酸微陣列（oligonucleotide microarray），兩項分子生物技術建立不同之乳酸菌鑑定平台，測試其分析單一純菌或複合菌相之檢驗能力，期望提高鑑菌結果之正確性與減化檢驗工作之流程。PCR-DGGE鑑菌平台建立第一步，即篩選四組引子對於目標乳酸菌群之區隔能力，選擇GC338f/518r引子所增幅之16S rDNA為最佳解析基因區段，使用於克弗爾粒（kefir grains）中之未知乳酸菌之測定與市售含乳酸菌產品之檢測。搭配培養方式分析由不同培養條件下純化之單一菌落，得知MRS培養基結合好氣條件培養可使最多不同種類之乳酸菌於此條件下生長，避免其他不適當培養下之菌群低估，同時配合定序方法與傳統鑑定菌種方式，確知PCR-DGGE鑑定乳酸菌之正確性與應用性。搭配培養方法可確認四不同菌種Lactobcillus kefiranofaciens、Lb. kefiri、Leuconostoc mesenteroides、Lactococcus lactis存在於克弗爾粒中；在不需培養方法中僅Lb. kefiranofaciens、Lb. kefiri或Lc. lactis可被檢出，另外亦檢出E. coli與Pseudomonas spp.之污染菌存在於樣品中。使用PCR-DGGE配合不需培養方法，應用於市售乳酸菌產品之菌種檢測，酸凝酪產品中可穩定測得Str. thermophilus，其次為Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus，此二者皆為酸凝酪發酵之常見菌種；乳酸菌飲品檢出之乳酸菌種類常較商品標示者多，最易檢出之菌種為Lb. acidophilus，其次為Lb. casei；凍乾菌粉類產品檢出之菌種則常少於標示者。PCR-DGGE於複雜菌相樣品之檢測效力仍受限於菌數多寡與菌體存活率。核苷酸晶片之設計，首先透過序列資料庫Ribosomal Database Project II取得目標菌群之16S rRNA基因序列，分別利用ARB與PRIMROSE兩探針設計軟體找尋適當之乳酸菌特異性寡核苷酸探針，並藉由安捷倫（Agilent）探針合成技術製作為晶片實體，16S rDNA樣品需進行95℃加熱5小時之前處理，造成1500 bp長度之核酸片段至20～150 bp，搭配ULS標定法標定目標核酸後，與晶片雜合之訊號強度穩定且極高，可供作為檢驗標準化流程。由5株目標菌（Lb. acidophilus、Lc. lactis、Str. thermophilus、Leu. mesenteroides及Bif. animalis）與1株非目標菌（B. cereus）之純菌樣品，與2混菌樣品（目標菌Lb. acidophilus混合非目標菌B. cereus與5株目標菌同時混合）分別進行雜合反應，依八組晶片表現差異分析探針之有效性，經GeneSpring GX軟體篩選探針後，在31組普遍性探針中，共有24組達預期效果可表現正控制組探針特性，僅有1組完全不具顯著訊號；於3573個乳酸菌探針中，已確認其中11 % 會與非目標菌產生偽陽性訊號，此外，種別探計實際檢測效果較屬別探針為佳，種別探針中表現true-positive訊號者，以Lb. acidophilus、Str. thermophilus與Bif. animalis探針設計效果最佳，可達50 %以上，Lc. lactis探針則僅約8 % 為有效探針，Leu. mesenteroides探針之效果最弱，僅1 % 可表現顯著訊號。非目標菌存在於檢測樣品或是多目標菌混合，並不會干擾有效探針之檢測效力，目標DNA量由0.5Lactic acid bacteria (LAB) are widely employed as starter cultures in the dairy industry and supplemented in different commercial products. Detecting and identifying various species of lactic acid bacteria with rapid method is often important for quality control of dairy products and monitoring fermentation processes. However, identification of lactic acid bacteria in the complex bacterial communities is still difficult for both phenotypic methods and genotypic methods. The aim of this study focused on polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) and oligonucleotide microarray method to develop a rapid, reproducible and easy to handle molecular tool for identification of lactic acid bacteria in dairy products.or PCR-DGGE, selection of primers is the key to analyze highly conserved genetic profiles among LAB. Four primer sets, targeted for 20 reference LAB strains, were evaluated and primer set GC338f/518r was selected due to its highly discriminating power at species level. After selection of primer sets, LAB in kefir grains and commercial probiotic products were assessed using PCR-DGGE by a culture-independent and a culture-dependent way, and were further confirmed by DNA sequencing techniques. Kefir grains results indicated that a combined method of cultivation with PCR-DGGE and subsequent DNA sequencing could successfully identify four LAB strains, Lactobacillus kefiranofaciens, Lb. kefiri, Leuconostoc mesenteroides and Lactococcus lactis from three kefir grains from Taiwan (named Hsinchu, Mongolia and Ilan). It was interesting to find that all three kefir grains contain similar LAB species. Furthermore, the DGGE as a culture-independent method indicated that Lb. kefiranofaciens was found in all three kefir grains, whereas Lb. kefiri was only observed in Hsinchu kefir grain and Lc. lactis was found in both Mongolia and Ilan samples. Two additional strains, Pseudomonas spp. and E. coli, were also detected in kefir grains. The DGGE profiles for commercial probiotic products demonstrated that the samples contained most lactic acid bacteria that specified on the product label except of the lyophilized mixed starter powder. This may be due to a concentration below the detection limit or due to the fact that none of these bacteria were present in the probiotic product. or microarray method, oligonucleotide probes targeting variable regions of the 16S rRNA gene were designed and tested for the identification of LAB. The strategy involved designing possible oligomer probes, using two software (ARB and PRIMROSE), for each target at species and genus level. All candidate 25-mer probes were poly(T)-tailed to reach an overall length of 60 oligonucleotides. Microarrays were manufactured by in situ synthesis (Agilent Technologies). Eight samples, including 5 pure LAB (Lb. acidophilus, Lc. lactis, Str. thermophilus, Leu. mesenteroides and Bif. animalis), 1 non-targeted stain (B. cereus) and 2 mixed strain, were then assessed. Results indicated that, of the 21438 individual hybridization reaction (3573 validated probes × 6 references strains), 20082 probes (93.67%) yielded the expected result by showing significantly differential signal. Further inspection of each species probe, over 50 % of species probes designed for Lb. acidophilus, Str. thermophilus and Bif. animalis had true-positive signals with target bacteria. Whereas, true-positive signals were lower than 10% for probes designed for Lc. lactis and Leu. mesenteroides. For mixed strain samples, most of significantly positive signals would not be decreased when the amount of target DNA was down to 0.1目 錄試委員會審定書謝錄 I次 VII次 IX要 ibstract iii一章 總論 1 前言 2 文獻整理 4 一、乳酸菌之鑑定與分類 4 （一） 細菌之分類演進、鑑定及命名 4 （二） 乳酸菌之分類 5 1. 屬間層級（genus level）之分類 6 2. 種間層級（species level）之分類 6 3. 乳酸桿菌屬（Lactobacillus） 7 4. 白念珠球菌屬（Leuconostoc） 7 5. 乳酸球菌屬（Lactococcus）與鏈球菌屬（Streptococcus） 8 6. 雙叉桿菌屬（Bifidobacterium） 8 （三） 乳酸菌之鑑定方法 9 1. 表現型法（phenotypic methods） 10 2. 基因型法（genetypic methods） 11 （1）特異性引子 122）定序 123）限制片段長度多型性 134）逢機增殖多型性DNA 145）脈衝電場膠體電泳 146）雜合探針法 157）聚合酶連鎖反應-變性梯度膠體電泳 15 （四） 可作為鑑定依據之目標基因 16 1. 16S ribosomal RNA 16 2. 23S ribosomal RNA 17 3. 核糖體核酸基因內轉錄區 17 4. 管家基因 18 二、聚合酶連鎖反應-變性梯度膠體電泳（PCR-DGGE） 18 （一）PCR-DGGE於食品微生物之應用 18二）PCR-DGGE缺點與限制 20三）影響PCR-DGGE檢測效能之因子 21 1. 目標序列（PCR引子對） 21 2. 電泳條件 22、微陣列（microarray）技術 22 （一） 長寡核苷酸探針（long oligoprobes） 26 （二） 短寡核苷酸探針（short oligoprobes） 27三） 影響寡苷酸微陣列晶片檢測效能之因子 28 1. 目標基因之雜合反應前處理 28. 探針設計之軟體應用 291）ARB software package 302）PRIMROSE software 31. 目標-探針不互補序列（target-probe mismatches）之種類、數目及位置 32二章 藉由變性梯度膠體電泳技術鑑定乳酸菌之研究 45 一、前言 46 二、材料與方法 47 （一）實驗材料 47 1. 菌種 47 2. 培養基 47 3. 試藥 47 4. 實驗儀器及器材 48二）實驗方法 49 1. 乳酸菌種與克弗爾菌元之保存與活化 49 2. 菌體DNA純化 49 3. 克弗爾粒中乳酸菌之分離 50. 聚合酶連鎖反應 50 5. 瓊酯膠體電泳 51 6. 變性梯度膠體電泳 51 7. 變性梯度膠片之核酸純化 52 8. DNA定序 52 9. 商用生化鑑定套組（API 50 CHL）之乳酸菌鑑定 53 三、結果與討論 58 （一）不同引子對鑑別乳酸菌株之能力 58 1. 引子對GCP1V1/P2V1 58 2. 引子對GC27f/Lab-0677r 58 3. 引子對GC338f/518r 59 4. 引子對GCHDA1/HDA2 60二）藉PCR-DGGE技術以培養或不需培養方法研究克弗爾粒中之乳酸菌群 66 1. 培養方法 67 （1）乳酸菌分離條件之選擇 67 （2）不同克弗爾粒中乳酸菌之分類與鑑定 68 2. 不需培養方法 70 3. 培養法與不需培養方法之比較 71三）藉PCR-DGGE技術以不需培養方法檢測市售產品之乳酸菌 77 四、結論- 83三章 藉由16S rRNA寡核苷酸微陣列晶片鑑定乳酸菌 85 一、前言 86 二、材料與方法 88一）實驗材料 88 1. 菌種 88. 培養基 88. 試藥 88. 實驗儀器及器材 89二）實驗方法 90 1. 目標DNA樣品之製備 901）菌種活化 902）菌體DNA純化 903）聚合酶連鎖反應 914）PCR產物純化 915）片段化處理 926）聚丙烯醯胺膠體電泳 927）純菌及混合菌種樣品之製備 938）螢光標定 93. 乳酸菌寡核苷酸晶片製作 941）序列資料庫建立 942）種間特異性及屬間特異性探針設計 94 a. ARB software package 94 b. PRIMROSE software 963）普遍性探針與負控制組探針設計 984）晶片訂製 99 3. 雜合反應 99 4. 訊號讀取及分析 100 三、結果與討論 107 （一）片段化處理之最適化 107 （二）探針訊號分析與篩選 111 1. 原始訊號之判讀與校正 111 2. 探針篩選 113 3. 普遍性探針之表現 114 4. 乳酸菌探針於八實驗組之共同偽陽性表現 115三）六組單一純菌晶片之探針表現 124 1. 各純菌晶片之探針表現 124 （1）目標菌株Lb. acidophilus之雜合表現 1242）目標菌株Lc. lactis subsp. lactis之雜合表現 1253）目標菌株Str. thermophilus之雜合表現 1264）目標菌株Leu. mesenteroides subsp. cremoris之雜合表現 1265）目標菌株Bif. animalis subsp. lactis之雜合表現 1276）目標菌株B. cereus之雜合表現- 128. 探針特性對微陣列訊號表現之影響 1291）Lb. acidophilus晶片上產生不同訊號表現之探針特性 1292）Lc. lactis晶片上產生不同訊號表現之探針特性 1313）Str. thermophilus晶片上產生不同訊號表現之探針特性 1334）Leu. mesenteroides晶片上產生不同訊號表現之探針特性 1345）Bif. animalis晶片上產生不同訊號表現之探針特性 135四）混合菌相晶片之探針表現 168. Lb. acidophilus與B. cereus混合之mix 2樣品 1681）僅在mix2組別表現顯著之探針 1682）僅在Lb. acidophilus組別表現顯著之探針 1683）僅在B. cereus組別表現顯著之探針 1694）同時在mix2及Lb. acidophilus組別表現顯著之探針 1695）同時在mix2及B. cereus兩組表現顯著之探針 1696）在mix 2、Lb. acidophilus與B. cereus三組別皆表現顯著之探針 169. 五株目標乳酸菌混合之mix 5樣品 1691）僅在mix5組別表現顯著之探針 1702）僅在純菌組別表現顯著之探針 1713）在mix 5與純菌組皆表現顯著之探針 172、結論 179結 181考文獻 183錄 201者小傳 221amp;#8195; 次1-1 乳酸菌之鑑別特徵 391-2 應用於乳酸菌鑑定之技術 401-3 多種應用於環境研究微陣列型式之主要差異 411-4 使用於微生物診斷微陣列之平台技術 421-5 寡核苷酸微陣列於微生物診斷研究之應用 432-1 本研究使用於PCR-DGGE分析之引子對 552-2 各引子之PCR反應條件 562-3 不同引子之PCR產物最適變性梯度膠體電泳分析條件 572-4 三組克弗爾粒培養分離乳酸菌株之16S rDNA定序結果 762-5 酸凝酪產品之包裝標示與PCR-DGGE鑑定結果 802-6 乳酸菌飲料品之包裝標示與PCR-DGGE鑑定結果 812-7 凍乾粉末產品之包裝標示與PCR-DGGE鑑定結果 823-1 ARB與PRIMROSE針對不同目標乳酸菌群設計而得之探針個數 1063-2 不同目標菌之探針原始訊號、校正控制值與校正後訊號範圍 1203-3 31組普遍性探針在不同實驗組晶片之校正訊號 1213-4 於8組晶片中均表現顯著之乳酸菌探針 1233-5 在6組純菌實驗組中，於各晶片上產生不同訊號表現之探針個數 1383-6 在6組純菌實驗組中，於各晶片上產生不同訊號表現之種別探針比例 1393-7 針對Lb. acidophilus設計之探針於6組純菌晶片上可產生true-positive與non-specific雜合反應者 1403-8 針對Lc. lactis設計之探針於六純菌晶片上可產生true-positive與non-specific雜合反應者 1413-9 針對Str. thermophilus設計之探針於六純菌晶片上可產生true-positive雜合反應者 1433-10 針對Leu. mesenteroides設計之探針於六純菌晶片上可產生true-positive雜合反應者 1443-11 針對Bif. animalis設計之探針於六純菌晶片上可產生true-positive與non-specific雜合反應者 1453-12 個別在Lb. acidophilus、Lc. lactis、Str. thermophilus、Leu. mesenteroides與Bif. animalis晶片中產生false-negative訊號之探針 1473-13 在6組純菌微陣列中僅於Lb. acidophilus晶片產生false-positive之探針1583-14 在6組純菌微陣菌中僅於Lc. lactis晶片產生false-positive之探針 1613-15 在6組純菌微陣列中僅於Str. thermophilus晶片產生false-positive之探針 1623-16 在6組純菌微陣列中僅於Leu. mesenteroides晶片產生false-positive之探針 1633-17 在6組純菌微陣列中僅於Bif. animalis晶片產生false-positive之探針 1653-18 在Lb. acidophilus、B. cereus與mix 2晶片表現顯著之探針 1743-19 在mix 5晶片表現顯著，但在個別純菌組別皆無顯著表現之探針 1763-20 至少在一個別純菌晶片表現顯著，但在mix 5晶片無顯著表現之探針 177amp;#8195; 次1-1 細菌之細胞組成與多相細菌分類學上所應用之技術概念圖。 331-2 現行技術應用於細菌分類學上之分類解析度。 341-3 以16S rRNA基因序列分析Lactobacillus、Pediococcus及Paralactobacillus屬中菌種之親緣演化關係樹狀圖。 351-4 以16S rRNA基因序列分析雙叉乳桿菌科中菌種之親緣演化關係樹狀圖。 361-5 PCR-DGGE之原理。 371-6 建立平行化微生物檢測工具時之考量因子。 382-1 本研究之實驗架構。 542-2 參考乳酸菌株以GCP1V1/P2V1引子獲得之PCR產物進行之變性梯度膠體圖譜。 622-3 參考乳酸菌株以GC27f/Lab-0677r引子獲得之PCR產物進行之變性梯度膠體圖譜。 632-4 參考乳酸菌株以GC338f/518r引子獲得之PCR產物進行之變性梯度膠體圖譜。 642-5 參考乳酸菌株以GCHDA1/HDA2引子獲得之PCR產物進行之變性梯度膠體圖譜。 652-6 以培養法在不同培養條件分離新竹組克弗爾粒中乳酸菌之DGGE圖譜 722-7 蒙古組與宜蘭組克弗爾粒中經培養法分離之乳酸菌DGGE圖譜。 732-8 三組克弗爾粒直接萃取之PCR產物片段進行DGGE圖譜。 742-9 三組克弗爾直接萃取之PCR產物片段進行DGGE圖譜。 753-1 乳酸菌寡核苷酸微陣列晶片實驗流程圖。 1013-2 ARB軟體匯入資料庫操作視窗。（a）僅匯入*.gb檔案格式之目標菌種資料庫序列。（b）使用Tree_Admin功能匯入*.tree檔案格式後之目標菌種資料庫。 1023-3 ARB軟體探針設計操作視窗。（a）探針設計參數之設定。（b）針對Lb. acidophilus設計所得之探針資料。 1033-4 PRIMROSE軟體探針設計操作視窗。（a）標記探針設計之目標菌群。（b）對Lb. acidophilus設計探針之設定參數。 1043-5 PRIMROSE軟體探針設計結果與RDP網站資料庫配對結果。（a）針對Lb. acidophilus設計所得之探針資料。（b）PriLbAci01探針與RDP網站全資料庫所得之配對菌群序列。 1053-6 不同片段化處理後對16S rDNA片段大小分布。 1093-7 95℃加熱5小時所致之16S rDNA片段大小。 1103-8 各實驗組之微陣列原始訊號強度分佈圖。 1163-9 18組負控制組探針於各實驗組之微陣列原始訊號強度分佈圖。 1173-10 各實驗組所獲得之微陣列校正訊號強度分佈圖。 1183-11 186組普遍性探針於各實驗組之校正訊號強度分佈圖。 1193-12 所有針對Leu. mesenteroides設計之探針之校正訊號強度。 167application/pdf4901411 bytesapplication/pdfen-US變性梯度膠體電泳寡核苷酸微陣列乳酸菌鑑定denaturing gradient gel electrophoresisoligonucleotide microarraylactic acid bacteriaidentificationthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/182049/1/ntu-98-F91626012-1.pdf