曾顯雄臺灣大學：植物病理與微生物學研究所童凱鴻Tong, Kai-HongKai-HongTong2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292005http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/58008樟芝是台灣特有具抗癌功效之真菌，本實驗欲獲得與樟芝三萜類生合成相關的基因群組之資訊，藉以進行樟芝具抗癌活性三萜類的相關研究，因此使用樟芝菌絲體建構cDNA library，再以經過定序的cDNA序列與NCBI資料庫進行序列比對，並從中篩選出ergosterol biosynthesis protein，Putative mevalonate kinase，Diphosphomevalonate decarboxylase，Farnesyl cysteine carboxyl methyltransferase，squalene epoxidase及Lanosterol 14 α-demethylase等可能與三萜類生合成相關且具顯著相似性之六個基因序列，並以此設計專一引子對，以gDNA為模板進行PCR，所得產物經定序、比對驗証確為上述基因之片段後，以DIG標識作為探針，並與所建構之Fosmid Library進行菌落雜合（colony hybridization），篩檢Fosmid DNA library中可能含有三萜類生合成基因群組的菌株，經實驗證實，上述六個基因並無組成任何基因群組。為進一步了解具抗癌活性的三萜類其生合成途徑，利用含fluconazole、butenafin、compactin等可阻斷三萜類代謝途徑的藥物培養樟芝菌絲，並將菌絲以甲醇萃取以進行HepG2及A549等癌細胞毒性測試與HPLC及TLC之分析，實驗結果顯示，compactin處理並未對樟芝的抗癌產生顯著影響，藉由butenafine處理使樟芝三萜類產生顯著改變，但其抗癌功能仍無明顯變化，而使用fluconazolet處理則使樟芝三萜類及其抗癌活性有明顯下降情形，因此猜測，對HepG2具有特異毒殺作用的三萜類產物可能是位於lanosterol 14α-demethylase下游之代謝產物，為確認此一假設，目前正利用siRNA的技術進行lanosterol 14α-demethylase基因之靜默化，期望藉此確定對HepG2肝癌細胞具有抑制效應的三萜類成分及其生合成路徑。Antrodia cinnamomea is a fungus endogenous to Taiwan and thought to have anticancer activities. In current study we attempt to analyze and elucidate the genes that possibly involved with terpenoids biosynthesis. Six putative genes：ergosterol biosynthesis protein，Putative mevalonate kinase，Diphosphomevalonate decarboxylase，Farnesyl cysteine carboxyl methyltransferase,squalene epoxidase and Lanosterol 14 α-demethylase , were identified from the A. cinnamomea cDNA library after blastX with nr NCBI database, and primers were designed to amplify these specific genes using gDNA of A. cinnamomea as template by polymerase chain reaction. The obtained gene products were further sequenced, and their identies verified, labeled with DIG and used as probe to screen the constructed A. cinnamomea Fosmid library. The results from colony hybridization revealed these genes were not allocated in a cluster. In order to investigate further on the possibility of terpenoids in anticancer activity, we used flucanazole, butenafin, and compactin, which are thought to block terpenoids biosynthesis pathway at specific steps. The effect of these inhibitors on A. cinnamomea were analyzed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Thin Layer Chromatography (TLC) in combination with the bioactivity assay using liver cancer cell Hep G2 and lung cancer cell A549. The results showed both the biosynthesis of terpenoids and the anticancer activity of A. cinnamomea were not significantly affected by compactin; with respect to butenafin, through the terpenoids varied greatly either qualitatively or quantitatively, the anticancer activity was not changed in a regular pattern; while flucanazole markedly reduced the biosynthesis of terpenoids as well as the anticancer activity. Consequently, it is suggested that the downstream terpenoids products mediated by lanosterol 14α-demethylase was mainly ascribed to the anticancer activity. Currently,we are conducting lanosterol 14 α-demethylase gene silencing by using siRNA to prove the actual role played by these gene products in suppression of the liver cancer cell Hep G2.前言…………………………….………………….1 前人研究 ㄧ、樟芝 1. 樟芝之命名沿革及其特徵……………………………………….….2 2. 牛樟菇的生理活性成分…………………………….………….…..3 3. 牛樟菇的培養條件及成分影響…………………………….….…..4 二、牛樟菇的藥用功效研究 1. 抗癌作用及其機制 …………………….…………………………..6 2. 抗氧化能力 ……………………………………..……………………7 3. 保肝作用 ………………………………………………………….…8 三、 樟芝三帖類(triterpenoids)基因研究 1. 三帖類(triterpenoids)簡介……………………………………….9 2. 樟芝三帖類(triterpenoids)之簡介………………………………10 3. 樟芝triterpenoids生合成之基因群組 ………………………….…11 四、 核醣核酸干擾（RNA interfrence；RNAi） 1. 核醣核酸干擾的發現史……………………………………….……12 2. 核醣核酸干擾的作用機制……………………………………….…13 3. siRNA的設計 ………………………………………………….……14 材料與方法 一、 菌株培養 1.供試菌株………………………………………………………………20 2. 培養基 ………………………………………………………………20 3. 培養時間……………………………………………………….……22 4. 通氣量……………………………………………………….………22 二、建構cDNA library及三萜類合成條件之確認 1. RNA萃取及純度、完整性檢驗 …………………………….………22 2. cDNA library 建構……………………………………………….…23 3. 以建構cDNA library其三萜類生合成培養條件之確認………………………………………………………………………….…23 三、尋找三萜類生合成相關基因 1. 尋找三萜類生合成相關基因及引子對設計……………….………23 2. 三萜類生合成相關基因之選殖……………………………….……24 3. 三萜類生合成相關基因之探針製備 ………………………………25 四、Fosmid DNA library建構 1. DNA萃取………………………………………………… ……….25 2. Fosmid library kit………………………………… …….……….26 3. Fosmid library colony hybridization……………………………28 五、樟芝培養條件與三萜類生合成基因之表現 1. 萃取不同培養條件的樟芝RNA………………………………….…29 2. 利用RT-PCR確認三萜類生合成相關基因表現情形………………29 3. 利用TLC及細胞培養確定震盪與否的影響………………….……29 4. 萃取不同培養時間的樟芝菌絲內含物………………………….…29 5. 利用TLC及細胞離體毒性試驗確定培養時間不同的影響…….…30 六、有效三萜類之種類及生成途徑 1. 利用抗真菌藥物阻斷三萜類的可能生合成途徑………….………30 2. 萃取樟芝內含物……………………………………………….……30 3. 利用TLC確定抗真菌藥物之效果……………………………….…31 4. 利用細胞培養尋找有效三萜類生合成途徑及抗癌機制……….…31 5. 利用HPLC找出有有抗癌功效的三萜類……………………………32 七、利用shRNA確認有效三萜類之基因徑 1. 大腸桿菌電穿孔轉形pAN7-1………………………………………33 2. Hygromycin B 敏感度測試…………………………………………33 3. shRNA設計與製備……………………………………………………33 4. shRNA載體構築………………………………………………………34 5.原生質體製備…………………………………………………………34 6. PEG轉型作用…………………………………………………………34 7. 樟芝轉型株篩選與分析………………………………………….…35 結果與討論 一、產生最多種三萜類的培養條件………………………39 二、三萜類生合成相關基因選殖…………………………39 三、Fosmid library 建構與選殖…………………………40 四、樟芝萃取物對不同細胞的影響………………………41 五、樟芝培養條件與三萜類生合成相關基因之表現……………………………………………………………………………41 六、有效三萜類之種類及其生合成途徑………………42 七、利用shRNA確認有效三萜纇之基因………………44 結論與未來展望 結論………………………………………………………………….……88 Future work…………………………………………………………………88 未來展望…………………………………………………………….…89 參考文獻………………………………………………………………90 圖目錄 圖一：樟芝子實體外觀…...……………………………………….……15 圖二：牛樟芝子實體模式標本之顯微特徵……………………….……15 圖三：異戊二烯單體結構………...…………………………………….16 圖四：由異戊二烯組成的各種萜類………………. …………..……….16 圖五：樟芝氧化態三萜類…………………………………………….….17 圖六：terpeniods生合成途徑概略………...………………………..…18 圖七：siRNA 作用示意圖…………………………………………….…19 圖八：pAN7-1電泳…………………………………………...…………36 圖九：pAN7-1之限制酶切位示意圖……………………………………37 圖十：震盪培養與靜置培養之三萜類TLC比較……………………….45 圖十一：不同培養條件下樟芝三萜纇之HPLC分析……………...…….46 圖十二：靜置培養32與震盪培養32天之HPLC分析比較…………….47 圖十三：三萜類生合成相關基因之PCR產物及探針………………….48 圖十四：三萜類生合成相關基因之PCR產物及探針…………………...49 圖十五：所建構Fosmid library的不同選殖株（clone），以限制酶 切割質體……………………………………………………..50 圖十六：FCCM、EBP、PMK、DPMD的Fosmid clone與DNA對照PCR…...…..51 圖十七：LAN和SE的Fosmid clone與DNA對照PCR………………..…...52 圖十八：靜置培養14天之ACME對不同癌細胞之細胞毒殺測試……....53 圖十九：靜置培養21天之ACME對不同癌細胞之細胞毒殺測試……54 圖二十：靜置培養32天之ACME對不同癌細胞之細胞毒殺測試……55 圖二十一：震盪培養使squalene大量產生……….…………………..56 圖二十二：RT-PCR顯示震盪培養對三萜類生合成上游基因的影響…57 圖二十三：震盪培養21天與靜置培養21天對纖維母細胞株3T3之影 響...……………………………………………………….…58 圖二十四：震盪培養21天與靜置培養21天對肺腺癌細胞株A549之影 響………………………………………………………….…59 圖二十五：震盪培養21天與靜置培養21天對肝癌細胞株HepG2之影 響…...…………………………………………………….….60 圖二十六：培養時間不同，其單位濃度ACME對3T3細胞株的影響….61 圖二十七：培養時間不同，其單位濃度ACME對A549肺癌細胞株的影 響……………………………………………………….....….62 圖二十八：培養時間不同，其單位濃度ACME對HepG2肝癌細胞株的影 響…...…………………………………………………….….63 圖二十九：加入compatin靜置培養21天所造成的TLC片影響……….64 圖三十：經compatin處理之樟芝三萜纇HPLC分析比較…….……….65 圖三十一：加入butenafine靜置培養21天所造成的TLC片影響……66 圖三十二：經butenafine處理之樟芝三萜纇HPLC分析比較……….67 圖三十三：加入fluconazole靜置培養21天所造成的TLC片影響…68 圖三十四：加入fluconazole靜置培養32天所造成的TLC片影響…69 圖三十五：經fluconazole處理之樟芝三萜纇HPLC分析比較…. …..70 圖三十六：compatin靜置培養21天對肝癌細胞株HepG2毒殺作用比較………………………………………………………….…71 圖三十七：butenafine靜置培養21天對肝癌細胞株HepG2毒殺作用之比較………………………………………………………..72 圖三十八：fluconazole靜置培養21天對肝癌細胞株HepG2毒殺作用之比較……………………………………………………...73 圖三十九：compatin靜置培養21天對肺癌細胞株A549毒殺作用之比較……………………………………………………………..74 圖四十：butenafine靜置培養21天對肺癌細胞株A549毒殺作用之比較……………………………………………………………..75 圖四十一：fluconazole靜置培養21天對肺癌細胞株A549毒殺作用之比較……………………………………………………...76 圖四十二：compatin靜置培養21天對3T3纖維母細胞毒殺作用之比較………………... ………... ………...…………………….77 圖四十三：butenafine靜置培養21天對3T3纖維母細胞毒殺作用之比較…………………………...…………...………….....….78 圖四十四：fluconazole靜置培養21天對3T3纖維母細胞毒殺作用之比較…...……………………….. …………...…….…….….79 圖四十五：可能對肝癌細胞具有特異專一毒殺力的三萜類………….80 圖四十六：樟芝對不同濃度hygromycin B的抗性檢測………………81 圖四十七：樟芝之EST contig 170………………………………………82 圖四十八 ：lanosterol 14α-demethylase具高度靜默化潛力片段83 圖四十九：lansh經MspI酶切……………..……………………………84 圖五十：ansh經MspI酶切純化之後進行黏結完成………..…………..85 表目錄 表一：三種阻斷三萜類生合成藥物之作用位置及其影響……………38 表二：六個與萜類生合成相關基因之引子對……………………….…86 表三：六個與三萜類生合成相關基因在fosmid library 對應的菌株 編號及hybridization結果……….…………………………….871936372 bytesapplication/pdfen-US牛樟芝三萜類Antrodia cinnamomeatritenpene[SDGs]SDG3otherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/58008/1/ntu-94-R91633014-1.pdf